李紅艷 張永貴 王 靜 季尚瑋 斯慶圖娜拉 王江濱 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033)

1992年，美國國立癌癥研究所的病理學(xué)家在患有肝細(xì)胞癌的A/JCr小鼠的體內(nèi)分離出一種新型螺桿菌，命名為肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus，H.hepaticus)〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，健康小鼠腹腔注射肝螺桿菌后，可出現(xiàn)慢性活動性肝炎，并在肝細(xì)胞外間隙及肝內(nèi)膽道系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)菌體，因此肝螺桿菌可能成為這種成年小鼠發(fā)生慢性肝炎及伴隨肝細(xì)胞癌的病因?qū)W因素。關(guān)于螺桿菌屬在人類肝臟疾病中可能起的作用知之甚少，但是在膽汁中通過 PCR檢測到 H.pylori的 DNA。Fox等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)H.hepaticus，H.bilis以及其他腸肝螺桿菌可能在慢性膽囊炎和慢性肝病的發(fā)病中起作用。本研究比較不同人群血清中抗H.hepaticus－IgG抗體和抗 H.pylori－IgG抗體反應(yīng)，同時分析兩種螺桿菌抗原之間的交叉反應(yīng)，為進一步了解H.hepaticus在慢性肝病中可能起的協(xié)同作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 (1)病例組為吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院消化內(nèi)科2007年10月至2009年6月期間不同肝病患者76名〔男50例，女26例，平均年齡(40.7±15.8)歲〕;診斷基于病史、生化學(xué)、免疫學(xué)和肝組織學(xué)檢查。血清酶學(xué)升高和/或臨床癥狀持續(xù)超過6個月可診斷為慢性疾病，其中慢性病毒性肝病患者52例(慢性乙型病毒性肝病27例、慢性丙型病毒性肝病25例)，自身免疫性肝炎8例和慢性酒精性肝病16例，患者合并有肝硬化25例。(2)正常體檢人群:作為成年人代表性樣本，隨機選自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院體檢中心80例，正常體檢人群〔男44例，女36例，平均年齡(43.8±16.4)歲〕。(3)健康獻血者:80例隨機選自長春市中心血站，男42例，女性38例，平均年齡(35.6±10.6)歲。所有標(biāo)本均檢測HBV和HCV陰性。所有標(biāo)本保存在－20℃。

1.2 H.hepaticus、H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株及培養(yǎng) H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51450購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(ATCC)，H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1由中國疾病控制中心診斷室提供。H.hepaticus、H.pylori凍存菌株經(jīng)布氏瓊脂培養(yǎng)基復(fù)蘇，于微需氧(5%O2，10%CO2，85%N2)、37℃、高濕度條件下分別培養(yǎng)7～10 d、3～4 d，可疑菌落經(jīng)鑒定為 H.hepaticus及 H.pylori后進行純培養(yǎng)2～3代，備用。

1.3 H.hepaticus、H.pylori抗原制備 分別選取穩(wěn)定傳代的H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51450及H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1，用無菌生理鹽水洗脫固體平板上的細(xì)菌，4℃、3000 r/min離心10 min后棄上清，重新加入生理鹽水并用毛細(xì)細(xì)管吹打，懸浮后再離心，收集細(xì)菌。然后用小體積無菌生理鹽水懸浮，冰浴超聲粉碎10 min，4℃、12000 r/min離心20 min，收集上清。細(xì)菌殘渣再超聲粉碎10 min，重復(fù)上述過程一次。合并兩次上清，測蛋白濃度，分裝后置－80℃保存，備用。

抗原濃度計算:超聲粉碎細(xì)菌抗原稀釋后，用U－341紫外可見分光光度計測260 nm和280 nm波長的吸光度值(A260、A280)，按下列公式計算濃度:

蛋白濃度(mg/ml)=(1.74×A280－0.75×A260)×稀釋倍數(shù)。

1.4 抗H.hepaticus、H.pylori多克隆抗體的制備 2 ml弗氏佐劑(首次免疫時應(yīng)用弗氏完全佐劑，以后應(yīng)用弗氏不完全佐劑)加熱后，放入無菌研缽內(nèi)，冷卻后緩慢分別滴入已獲得的H.hepaticus、H.pylori超聲粉碎抗原(200 μg/ml)2 ml，研磨至乳白色黏稠的油包水乳劑。免疫方法采用背部多點注射法，即在家兔脊柱兩旁選6點皮下注射，每點注射0.2 ml，間隔10 d后再于上述部位選不同點注射。每次免疫的抗原量約100 μg。每次免疫1 w后，耳緣靜脈取血檢測抗體效價。當(dāng)效價在1∶16以上時心臟采血分離血清制備抗H.hepaticus及抗H.pylori抗體。

1.5 血清抗 H.hepaticus－IgG抗體、抗 H.pylori－IgG抗體檢測

應(yīng)用H.hepaticus、H.pylori超聲粉碎抗原包被ELISA反應(yīng)板。將1∶100稀釋的待測血清100 μl加入H.hepaticus抗原包被的ELISA反應(yīng)孔中，H.hepaticus、H.pylori抗原免疫兔子獲得的多克隆抗體作為陽性對照，H.hepaticus、H.pylori抗原免疫兔子前的血清作為陰性對照，PBS作為空白對照，封蓋后37℃孵育1 h。用漂洗液漂洗3次。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(待測血清中加羊抗人二抗，陽性對照、陰性對照和空白對照中加羊抗兔二抗)(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及抗兔二抗由華特生生物技術(shù)有限公司提供)稀釋液(1∶500)100 μl，封蓋后37℃孵育1 h。漂洗3次后每孔加入顯色液100 μl，37℃避光顯色20 min，加入0.2 N的硫酸終止顯色。在酶標(biāo)儀上讀取450 nm的光密度(OD)值。ELISA結(jié)果用相對抗體活性(relative antibody activity RAA)表示，RAA是參照標(biāo)準(zhǔn)(丙種球蛋白，山西康寶生物制品股份有限公司)的百分?jǐn)?shù)作為吸光率值的修正均值。比較三組每種螺桿菌的RAA均值。

1.6 吸收試驗 為了吸收可能的抗體交叉反應(yīng)，超聲處理H.pylori整個細(xì)胞，收集 H.pylori細(xì)胞用PBS(pH7.2)洗滌1次，冰內(nèi)超聲處理8次，每次60 s，每次間隔30 s，平均輸出功率45 W。將1 ml超聲處理的細(xì)胞加入到PBS中，加入10 μl血清，在22℃孵育1 h，然后在6°C不停搖勻16 h。12000 r/min離心10 min移去細(xì)胞，收集上清液用于血清學(xué)檢查。作為對照，H.pylori抗體完全吸收，被吸收后的血清再次做ELISA，三組人群中H.pylori平均RAA值均低于吸收試驗前的水平。

2 結(jié)果

2.1 吸收試驗前后三組人群抗H.hepaticus－IgG和抗H.pylori－IgG抗體的相對抗體活性分析 吸收實驗前CLD患者抗H.hepaticus－IgG抗體RAA平均值明顯高于獻血者組和普通體檢人群組(P＜0.001);CLD患者和普通體檢人群抗H.pylori－IgG抗體的RAA平均值明顯高于獻血者(P＜0.001)。CLD組抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA平均值在吸收試驗前后差異無顯著性變化(P＞0.05);普通體檢人群和獻血者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA平均值在吸收試驗后有所增高，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 吸收試驗前后三組人群抗H.hepaticus和H.pylori抗體的相對抗體活性(±s)

表1 吸收試驗前后三組人群抗H.hepaticus和H.pylori抗體的相對抗體活性(±s)

與CLD組比較:1)P＜0.001;與獻血組比較:2)P＜0.001

H.pylori CLD組 76 40.85±16.92 35.79±16.8041.23±18.502)組別 n 吸收實驗前 吸收實驗后體檢人群組 80 25.52±7.87 30.46±11.2242.10±11.342)獻血者組 80 17.93±7.321)18.22±7.11 27.26±8.03

2.2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對抗體活性分析 CLD患者中除自身免疫性肝炎患者外，慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA均明顯增高，慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA值明顯高于其他肝病患者(P＜0.001)，吸收試驗前后抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA值無顯著性變化(P＞0.05)。見表2。

表2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus抗體的相對抗體活性(RAA，±s)

表2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus抗體的相對抗體活性(RAA，±s)

與丙肝患者比較:1)P＜0.001

組別 吸收試驗前 吸收試驗后乙肝患者(n=27) 34.70±12.021) 28.55±12.631)丙肝患者(n=25) 57.68±13.27 50.72±16.07自身免疫性肝炎(n=8) 17.83±4.241) 17.77±3.231)酒精性肝病(n=16) 32.97±8.261) 31.65±8.181)

3 討論

H.hepaticus自發(fā)現(xiàn)并分離至今，國內(nèi)外研究顯示在世界范圍內(nèi)不同品系實驗室小鼠中均不同程度存在H.hepaticus感染〔3〕。H.hepaticus主要定植于小鼠的下胃腸道及肝臟，除A/JCr小鼠外，還能誘發(fā) C3H/HeNCr、BALB/cAnNCr、SCID/NCr等多種品系的小鼠發(fā)生腸道炎癥及慢性活動性肝炎，甚至并發(fā)肝癌〔1，4〕。螺桿菌菌屬是一組革蘭陰性、微需氧螺旋彎曲狀細(xì)菌，最初從人類及其他哺乳動物的胃組織中分離出來的〔5〕，研究顯示這類細(xì)菌可能與人或動物的胃腸道、肝膽系統(tǒng)和一些惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)〔6，7〕。因此進一步研究這些新型螺桿菌在人類肝病中可能的作用具有重要意義。

本研究三組人群中慢性肝病患者吸收試驗后H.hepaticus抗體反應(yīng)仍保持較高水平，同時慢性肝病患者中除自身免疫性肝炎患者外，慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對抗體活性均明顯增高，慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對抗體活性明顯高于其他肝病患者，表明這種螺桿菌抗原或其他未被鑒定的螺桿菌的抗體反應(yīng)具有特異性，這種微生物有可能參與了慢性肝病的發(fā)病機制。在普通人群和獻血者吸收試驗后H.hepaticus的抗體反應(yīng)反而有所增加，這一發(fā)現(xiàn)目前還無法解釋。

Roe等〔8〕在各種膽管疾病患者的膽汁中檢測螺桿菌DNA，應(yīng)用螺桿菌屬特異性PCR在原發(fā)硬化性膽管炎和原發(fā)膽汁性肝硬化患者肝組織中檢測到螺桿菌包括H.pylori。在近50%患者膽汁和肝臟標(biāo)本螺桿菌DNA陽性。在另一研究中〔9〕，膽管癌、肝細(xì)胞癌患者應(yīng)用螺桿菌屬特異性引物檢測71%和75%肝臟標(biāo)本螺桿菌屬PCR陽性。最近，一種與H.pylori相似的菌株從肝豆?fàn)詈俗冃愿斡不曰颊叩母闻K中分離出來，證實螺桿菌可以感染人類肝臟。

總之，在本研究中發(fā)現(xiàn)H.hepaticus和H.pylori的細(xì)胞表面蛋白具有較高的交叉反應(yīng)，提示菌屬特異性具有免疫原性蛋白用于酶免疫測定時需要鑒定和純化。慢性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對抗體活性在吸收試驗后仍保持較高水平，這些發(fā)現(xiàn)提示在慢性肝病患者體內(nèi)存在H.hepaticus的感染，但其在人類肝病發(fā)生發(fā)展中可能的協(xié)同致病作用還需要進一步研究探討。

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