于 靜 孫紅霞 (北華大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林 吉林 3203)

心肌纖維化(MF)表現(xiàn)為以心室成纖維細(xì)胞增殖和間質(zhì)膠原過(guò)度沉積及異常分布為特征的心臟重構(gòu)。血管緊張素(Ang)Ⅱ通過(guò)心室成纖維細(xì)胞(CFb)上的AT1受體，導(dǎo)致CFb增殖和膠原合成增加，引起心肌纖維化〔1〕。目前的研究結(jié)果顯示，依那普利拉(Ena)是依那普利的活性成分，可用于治療高血壓、心肌梗死、心力衰竭、心室重構(gòu)等疾病，但其抑制mF的分子機(jī)制，尤其信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究很少〔2〕。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上觀察Ena對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)CFb增殖、細(xì)胞周期、Ⅲ型膠原纖維(collagen)Ⅲ含量、蛋白酶C(PKC)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)－β1蛋白表達(dá)及PKC抑制劑白屈菜赤堿(Chele)對(duì)上述各指標(biāo)影響，揭示其抗MF作用的信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器及細(xì)胞 Ena(江蘇常州制藥廠200616);白屈菜赤堿，胰蛋白酶:寶泰克生物試劑;AngⅡ，PKC，TGF－β1(小鼠抗大鼠單克隆抗體)、四氮唑鹽(MTT)均為sigma公司產(chǎn)品;IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone Utah公司;胎牛血清(FCs):杭州四季青;Heraeus型CO2培養(yǎng)箱;SUNRISE TECAN FO39300型自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀(澳大利亞);日本Olympus倒置顯微鏡;超凈工作臺(tái);S－P免疫組化試劑盒:福州邁新;出生1～3 d的Wistar大鼠心室，胰酶消化，收集細(xì)胞，置于含100 ml/L FCs的IMDM培養(yǎng)液中，在 50 ml/L CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)60～90 min。采用差速貼壁法，分離CFb，加入含100 ml/L FCs的IMDM繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)倒置顯微鏡、透射電鏡、免疫組化纖維黏連蛋白染色陽(yáng)性和平滑肌肌動(dòng)蛋白染色陰性鑒定為所需的CFb，純度達(dá)98%，生長(zhǎng)近融合時(shí)按1∶3傳代，實(shí)驗(yàn)采用2～4代細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 分為五組，Control:含有IMDM的培養(yǎng)液;AngⅡ組:培養(yǎng)液中加入終濃度為10－7mol/L的AngⅡ;Chele+AngⅡ組:培養(yǎng)液中同時(shí)加入終濃度為 10－7mol/L AngⅡ和10－6mol/L Chele;Chele+AngⅡ+Ena組:培養(yǎng)液中同時(shí)加入10－7mol/L AngⅡ 和 10－6mol/L Chele 及 10－6mol/L Ena;10－6mol/L Ena組:培養(yǎng)液中同時(shí)加入 10－6mol/L Ena和10－7mol/L AngⅡ。

1.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 各組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組細(xì)胞7復(fù)孔，藥物干預(yù)24 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入5 g/L MTT 10 μl，待形成藍(lán)紫色的結(jié)晶沉淀后加入DMSO 150 μl使沉淀降解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值(A值)，用只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。各實(shí)驗(yàn)組與AngⅡ相比較的光吸收值(A值)差值百分率表示CFb增殖抑制率。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 各處理組作用24 h后，收集各組細(xì)胞，－20℃ 70%乙醇過(guò)夜后，冰浴，離心，重懸于 PBS，取適量細(xì)胞懸液加入RNA酶，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶染液，暗處冰浴30 min。上機(jī)前用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾。根據(jù)碘化丙啶所標(biāo)記的DNA含量確定細(xì)胞所處的周期。計(jì)算出細(xì)胞周期各時(shí)相分布的百分比。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)collagenⅢ表達(dá) 將CFb放入預(yù)先放置有幾張7 mm×7 mm蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，各種處理因素作用24 h后，將蓋玻片取出后用PBS洗滌2次，多聚甲醛固定，SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，具體步驟參照說(shuō)明。PBS取代一抗作陰性對(duì)照。胞質(zhì)顯示棕黃色顆粒細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，將玻片于光學(xué)顯微鏡下放大400倍，通過(guò)ALTAU2圖像采集卡采集圖像，Image－ProPlus4.5圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析，其陽(yáng)性追蹤點(diǎn)為表達(dá)于胞質(zhì)的棕黃色定位。計(jì)算切片各視野陽(yáng)性點(diǎn)面積總和及光密度均值，分析各組collagenⅢ在CFb中的平均陽(yáng)性強(qiáng)度百分比(%)。

1.6 免疫印跡檢測(cè)PKC和TGF－β1蛋白 各處理因素分別作用于24 h后，收集細(xì)胞，蛋白提取用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100 V 20 mA電轉(zhuǎn)移2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h，加1∶1000稀釋的小鼠抗大鼠TGF－β1單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，用1∶200稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體室溫孵育2 h，洗膜，DAB顯色。采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析PKC和TGF－β1灰度值，用其與β－actin比值表示蛋白質(zhì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IC檢測(cè)collagenⅢ表達(dá) 與對(duì)照組(5.65±1.09)相比，AngⅡ組(15.89±3.77)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)增加，collagenⅢ表達(dá)量明顯增加(P＜0.01);與 AngⅡ相比，Chele+AngⅡ組(7.34±1.67)和AngⅡ+Ena組(6.84±2.57)collagenⅢ表達(dá)降低(P＜0.01)，AngII+Chele+Ena組最為明顯(4.67±1.16)(P＜0.001)，與 AngⅡ +Chele組比較也有顯著差異(P＜0.01)。說(shuō)明AngⅡ通過(guò)激活PKC通路促進(jìn)膠原纖維蛋白分泌;各干預(yù)組能不同程度抑制collagenⅢ表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.2 MTT法檢測(cè)對(duì)CFb增殖的抑制作用 AngⅡ能顯著提高CFb對(duì)MTT的代謝率，MTT值明顯升高，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.001)，說(shuō)明AngⅡ?qū)Fb有明星促增殖作用，加入各不同處理因素后，各組MTT值顯著低于AngⅡ組，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 AngⅡ組CFb S期的細(xì)胞百分率顯著高于對(duì)照組，G0/G1期細(xì)胞百分率顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);給予各不同處理因素后，CFb S期的細(xì)胞百分率顯著降低，而 G0/G1期細(xì)胞百分率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表2。

圖1 免疫組化染色法檢測(cè)Chele和Fna對(duì)collagenⅢ表達(dá)的影響

表1 Chele和Ena對(duì)CFb增殖的抑制作用( ± s，n=7)

表1 Chele和Ena對(duì)CFb增殖的抑制作用( ± s，n=7)

與Control組比較:1)P＜0.001;與AngⅡ組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與AngⅡ+Chele組比較:4)P＜0.05

組別 MTT－OD 抑制率(%)50.10 Control 0.2735±0.1471 69.80 AngⅡ 0.9055±0.13461) －AngⅡ +Chele 10－6 0.4132 ±0.15473) 54.38 AngⅡ +Chele+Ena10－6 0.3153 ±0.12013)4) 65.18 AngⅡ +Ena10－6 0.4518 ±0.23182)

表2 Chele和Ena對(duì)細(xì)胞周期的影響( ± s，n=7，%)

表2 Chele和Ena對(duì)細(xì)胞周期的影響( ± s，n=7，%)

與Control組比較:1)P＜0.01;與AngⅡ組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與AngⅡ+Chele組比較:4)P＜0.05;下表同

組別 G0/G1 S G2/M 1.2±1.8 Control 83.7±2.6 10.11±4.1 6.19±1.7 AngⅡ 75.6±8.71) 20.6±3.81) 3.8±1.5 AngⅡ +Chele 10－6 90.2±4.32) 5.6±3.12) 4.2±3.5 AngⅡ +Chele+Ena 10－6 92.6±5.33)4) 3.3±1.23)4) 4.1±3.0 AngⅡ +Ena10－6 91.7 ±2.53) 7.1 ±2.32)

2.4 Western印跡檢測(cè)PKC和TGF－β1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，AngⅡ組PKC和TGF－β1蛋白表達(dá)量明顯升高(P＜0.01)。與AngⅡ相比，Chele+AngⅡ組和 Ena+AngⅡ組對(duì) PKC和TGF－β1的蛋白表達(dá)具有明顯的抑制作用(P＜0.05)，AngⅡ+Chele+Ena10－6組抑制作用最強(qiáng)(P ＜0.01)，且與 Chele+AngⅡ組比較有顯著差異(P＜0.05)，見(jiàn)圖2，表3。

圖2 免疫印跡檢測(cè)Chele和Ena對(duì)PKC和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

表3 Chele和Fna對(duì)PKC 和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響( ± s，n=6)

表3 Chele和Fna對(duì)PKC 和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響( ± s，n=6)

組別 PKC/β－actin TGF－β1/β－actin Control 1.00±0.16 1.00±0.25 AngⅡ 3.98±0.521) 9.66±1.511)Chele+AngⅡ 1.91±0.332) 3.79±0.252)AngⅡ +Chele+Ena 10－6 0.95 ±0.123)4) 1.16 ±0.472)4)AngⅡ +Ena10－6 2.82 ±0.272) 2.87 ±0.252)

3 討論

心肌纖維化(MF)表現(xiàn)為心室CFb過(guò)度增殖，間質(zhì)膠原分泌增加，并參與心室重塑。文獻(xiàn)報(bào)道，多種信號(hào)通路參與了MF發(fā)生和發(fā)展〔3，4〕。AngⅡ通過(guò)作用于CFb上的AT1型受體，通過(guò)G蛋白激活磷脂酶C(PLC)，PLA2和PLD。PLC催化PIP2生成二?；视?DG)和三磷酸肌醇(IP3)，IP3促進(jìn)Ca2+的釋放，可間接活化PKC，DG直接活化PKC從而促進(jìn)心室CFb增殖。PKC活化后還可直接經(jīng)核蛋白磷酸化，與轉(zhuǎn)錄因子c－Myc、NF－κB、c－Fos、c－Jun(c－Fos，c－Jun 構(gòu)成活性蛋白 AP－1)結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，還可激活MAPK等途徑誘導(dǎo)MF發(fā)生 ROS－MAPK〔4〕。

TGF－β1是導(dǎo)致MF等諸多因素最后的共同中介之一，能使體外培養(yǎng)細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增加，并增加Ⅰ型膠原mRNA的穩(wěn)定性。近年研究發(fā)現(xiàn)，TGF－β1和AngⅡ之間有密切作用，在心肌纖維化過(guò)程中，AngⅡ增加TGF－β1基因的表達(dá);而TGF－β1則抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，增加細(xì)胞外基質(zhì)mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)合成〔5〕。TGF－β1在心肌中對(duì)于細(xì)胞增殖、分化、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積均有重要的作用，TGF－β1受體在心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞均有分布〔5〕，實(shí)驗(yàn)證明新生鼠心肌細(xì)胞表面存在 TGF－β1Ⅰ型受體、Ⅱ型受體和Ⅲ型受體〔6〕。TGF－β1受體還存在于心肌成纖維細(xì)胞〔7〕。Yao〔8〕等發(fā)現(xiàn)在心肌成纖維細(xì)胞中，TGF－β1可激發(fā)膠原酶和膠原酶啟動(dòng)子的活性。有實(shí)驗(yàn)證明AngⅡ通過(guò)TGF－β1誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的合成〔9〕。丹參酮系唇形科丹參的干燥根提取物，是常用的活血化瘀中藥，研究表明丹參在治療心腦血管疾病及抗衰老等方面具有顯著療效。其抗心肌纖維化作用較為肯定的是丹參酮ⅡA，具有抗急性缺氧、抗心律失常、改善血管平滑肌、抗心肌肥厚以及抗血小板聚集等作用〔10〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PKC抑制劑Chelerythrine能明顯抑制AngⅡ促CFb增殖和collagenⅢ分泌，降低TGF－β1蛋白表達(dá)，抑制CFb增殖作用。說(shuō)明AngⅡ誘導(dǎo)MF作用通過(guò)激活PKC信號(hào)通路實(shí)現(xiàn);Chele+Ena組共同作用后，可使AngⅡ作用下的CFb MTT－OD值進(jìn)一步降低，同時(shí)Ⅲ型膠原含量明顯下降，細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞百分比明顯增多，S期細(xì)胞百分比明顯減少，PKC和TGF－β1蛋白表達(dá)減少，與Chele+AngⅡ比較有顯著差異。表明Ena可能與Chele協(xié)同作用，通過(guò)阻斷PKC通路，抑制TGF－β1蛋白表達(dá)從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFb增殖和間質(zhì)纖維分泌，顯示細(xì)胞內(nèi)PKC活性受到抑制后AngⅡ誘導(dǎo)的CFb增殖受阻。Chele+AngⅡ組和Ena+AngⅡ組比較上述各指標(biāo)無(wú)顯著差異，Ena組與AngⅡ組比較，數(shù)值雖有不同程度下降，但尚未降至正常水平，表明Ena只是部分阻斷PKC激活通路，由此看出除PKC參與AngⅡ促CFb增殖過(guò)程外，可能還有其他的通路存在〔11，12〕。

由上可知，AngⅡ通過(guò)作用于CFb AT1受體，激活PKC通路，促進(jìn)CFb增殖和膠原合成，誘導(dǎo)MF的發(fā)生。Ena通過(guò)部分抑制PKC通路的激活，降低CFb增殖和間質(zhì)纖維蛋白的合成和分泌，拮抗AngⅡ的部分生物活性，降低TGF－β1蛋白表達(dá)，抑制心室CFb增殖和纖維分泌，從而抑制MF的發(fā)生。其通過(guò)何種機(jī)制阻斷PKC通路，是直接還是間接作用，阻斷哪種PKC亞型，有待于后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

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