姚路明 (長春前進(jìn)醫(yī)院，吉林 長春 130062)

大腸癌是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，在我國近幾年發(fā)病率明顯上升〔1〕。隨著生物科學(xué)及醫(yī)學(xué)水平的提高，腫瘤生物治療取得了迅速發(fā)展，是繼手術(shù)、化療、放療后又一重要的治療手段。生物治療應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)或腫瘤生長進(jìn)行調(diào)控，從而抑制腫瘤生長〔2〕。本研究觀察超抗原SEA對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制率，旨在為大腸癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 SW480細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈(zèng)，SEA由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。噻唑藍(lán)(MTT)試劑、RPMI1640培養(yǎng)基為美國Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 取指數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)100 μl/孔，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%匯合時(shí)，每孔內(nèi)分別加入不同濃度的SEA溶液0、20、40、80 ng/ml，每個(gè)濃度 10 復(fù)孔，靜止培養(yǎng) 24 h，于結(jié)束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后加入二甲基亞砜150 μl/孔，振蕩5 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm波長處測(cè)量各孔吸光度A值，按下列公式計(jì)算SW480細(xì)胞增殖抑制率。SW480細(xì)胞增殖抑制率=(1－加藥孔細(xì)胞A值÷對(duì)照孔細(xì)胞A值)×100% 。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為50 ml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)后經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞PBS洗二次，70%冷乙醇固定，4℃內(nèi)保存，上機(jī)前過40目尼龍網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果以Modifi 2.0軟件分析。

1.2.3 透射電子顯微鏡 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.2，培養(yǎng)結(jié)束后分別收集不同濃度SEA作用的SW480細(xì)胞，離心棄上清，沉淀細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛－鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件分析，組間比較采用t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 不同濃度的SEA對(duì)SW480細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 不同濃度的SEA對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制率(±s)

表1 不同濃度的SEA對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制率(±s)

組別 A值 抑制率 P值1.52±0.12 － －20 ng/ml組 1.24±0.14 18.5% ＜0.01 40 ng/ml組 0.95±0.17 37.6% ＜0.01 80 ng/ml組0 ng/ml組0.83±0.24 41.5% ＜0.01

2.2 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果 不同濃度的SEA對(duì)SW480細(xì)胞增殖周期均有影響，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，且細(xì)胞凋亡率升高。見表2。

2.3 透視電子顯微鏡結(jié)果 圖1可見，20 ng/mlSEA組SW480細(xì)胞腫脹，有空泡形成;40ng/mlSEA組SW480細(xì)胞脆質(zhì)呈條索狀，線粒體腫脹;80 ng/ml SEA組SW480細(xì)胞核染色質(zhì)趨邊、凝集，可見凋亡小體。

表2 不同濃度的SEA對(duì)SW480細(xì)胞周期進(jìn)程影響(±s，%)

表2 不同濃度的SEA對(duì)SW480細(xì)胞周期進(jìn)程影響(±s，%)

32.5±2.1 63.2±3.6 4.3±1.9 1.6 20 ng/ml組 44.6±3.8 39.8±4.7 15.6±2.6 11.2 40 ng/ml組 54.2±4.4 26.5±3.3 19.3±2.1 17.8 80 ng/ml組凋亡率0 ng/ml組組別 G0/G1 S G2/M 59.6±4.2 18.2±3.1 22.3±3.7 20.4

圖1 透視電子顯微鏡觀察各組SW480(×5 000)

3 討論

SEA是一組對(duì)熱穩(wěn)定的可溶性蛋白質(zhì)，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常見病因〔3〕。SEA屬于外源性超抗原物質(zhì)，不需加工直接與MHCⅡ類分子結(jié)合形成配體，通過該配體抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)作為超抗原物質(zhì)可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生淋巴因子，參與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)。

本研究中MTT結(jié)果顯示不同濃度的SEA對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制具有明顯的劑量依賴性，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，不同濃度的SEA對(duì)SW480細(xì)胞周期進(jìn)程均有影響。SEA具有直接的細(xì)胞毒效應(yīng)，能夠抑制G1期細(xì)胞向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)程，使G1期細(xì)胞堆積，不能進(jìn)入S期，停止于G1期，造成S期細(xì)胞減少，從而使G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反映〔4〕。G1期細(xì)胞又稱細(xì)胞復(fù)制前期，G1期制造和產(chǎn)生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白體，同時(shí)G1期也是多種化學(xué)藥物作用的敏感點(diǎn)〔5〕。因此，抑制G1期細(xì)胞的進(jìn)程，從而使細(xì)胞增殖變緩，可達(dá)到抑制腫瘤增殖的目的〔6〕。

綜上所述，本研究應(yīng)用SEA直接作用于SW480細(xì)胞，獲得較為滿意的結(jié)果。證明SEA具有直接的細(xì)胞毒作用，可用于腫瘤的局部治療。

1 高 巍，劉尚梅.結(jié)直腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的研究進(jìn)展〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2011;38(9):693-6.

2 劉 娣，許曉群，王郡甫.IL-24的生物學(xué)特征及其抗腫瘤作用機(jī)制〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2010;37(9):657-61.

3 Thomas D，Chou S，Dauwalder O，et al.Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins〔J〕.Chem Immunol Allergy，2007;93:24-41.

4 Eillnger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss，2000;5(6):491-8.

5 Martin LG，Demers GW，Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papiloma Viras type/6 E7-expressing human cells in associated regulation of cyclin E〔J〕.J Virol，1998;72(2):975-85.

6 Jie KG，Jiang H，Sun L，et al.The pilot study of anti-tumor effects versus immunosuppression of Staphylococcal Enterotoxin C〔J〕.Cancer Biol T-her，2007;6(10):1584-91.