朱未名 胡海燕 陳 翔 毛丹丹 葉光華 (溫州鹿城精神病醫(yī)院，浙江 溫州 325003)

阿爾茨海默病(AD)發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而不斷增加，已成為繼心臟病、腫瘤和腦卒中之后的第四位死亡原因，給家庭和社會(huì)帶來(lái)很大負(fù)擔(dān)。中醫(yī)對(duì)AD的治療有上千年的歷史，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。本文探討清心開竅方皂苷對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)及Aβ表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及藥物 SPF級(jí)SD大鼠40只，雄性，體重(250±20)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供〔許可證號(hào):SCXK(湘)2009-0004〕。Aβ25～35由北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。清心開竅方由生地、麥冬、白芍、石斛、丹皮、茯神、陳皮、知母、石菖蒲等組成(湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供)。鹽酸多奈哌齊(安理申)由衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào):100223A)。

1.2 試劑與儀器 GFAP、Aβ、淀粉樣前體蛋白(APP)、白介素(IL)-1β免疫組化試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色劑由武漢博士德生物工程有限公司提供。BMJ-1生物組織包埋機(jī)(天津航空機(jī)電公司)。Shandon325型石蠟切片機(jī)(英國(guó)Shandon公司)。DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)。Motic B5顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)。MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北航公司)。

1.3 方法

1.3.1 清心開竅方總皂甙成分的提取 清心開竅方經(jīng)水提醇沉法得到初提藥液，然后采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等提取分離，得到含70%總皂甙成分的清心開竅方制劑〔1〕。

1.3.2 造模方法 聚集態(tài)Aβ25～35的準(zhǔn)備:按說(shuō)明書配置，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩D的模型制造參照文獻(xiàn)方法〔2～4〕進(jìn)行。除正常組外，其余各組均將Aβ25～35注入大鼠雙側(cè)杏仁核，通過(guò)Aβ的神經(jīng)毒作用，造成類AD模型。

1.3.3 動(dòng)物分組及給藥方法 經(jīng)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，于造模前進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練3 d，剔除差異明顯者。稱體重后按隨機(jī)數(shù)字表分為7組:正常組、模型組、清心開竅方組(清開組)、皂苷組及安理申組，每組8只。依標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物體質(zhì)量法，清心開竅方組、皂苷組及安理申給藥分別相當(dāng)于60 kg成人用藥的20倍。于造模后第2天灌胃，每天1次，其余各組用等量的雙蒸水灌胃，連續(xù)2 w，水迷宮測(cè)試期間，于測(cè)試前30 min給藥。

1.3.4 行為學(xué)檢測(cè)方法 采用Morris水迷宮法。全部給藥結(jié)束后開始水迷宮測(cè)試，在水池中注入清水，水面高出平臺(tái)2 cm，水溫控制在(21±1.5)℃。平臺(tái)置于某一象限中間，在其他3個(gè)象限中任選一入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠在水中游泳尋找并爬上平臺(tái)的路線圖、所需的時(shí)間(即潛伏期)，潛伏期的時(shí)間長(zhǎng)短作為學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。設(shè)定最長(zhǎng)游動(dòng)時(shí)限為60 s，如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，需將其引至平臺(tái)并停留10 s以強(qiáng)化記憶，這時(shí)所需時(shí)間記為60 s。每天訓(xùn)練2次，連續(xù)5 d。第6天撤除平臺(tái)，記錄大鼠在1 min內(nèi)跨越平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)，作為空間探索能力的指標(biāo)。

1.3.5 標(biāo)本制備方法 第15天處死動(dòng)物，冰臺(tái)上迅速取出腦組織，分離海馬，放入4%多聚甲醛固定液中固定，將固定好的大腦組織取出，室溫下經(jīng)梯度酒精脫水(70%A→80%A→95%AⅠ→95%AⅡ→100%AⅠ→100%AⅡ)，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，備用。

1.3.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法 石蠟切片厚5 μm，裱于用APES處理過(guò)的載玻片上，置45℃溫箱內(nèi)烤片24 h。切片常規(guī)脫蠟至水。滴加 3% H2O2室溫孵育 10 min，蒸餾水洗2 min/次×3。熱修復(fù)抗原10 min，PBS洗2 min/次×3。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10 min，甩去多余血清。滴加特異性抗體，置濕盒內(nèi)4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗3 min/次×3。滴加生物素化 IgG，置濕盒內(nèi)37℃溫箱內(nèi)孵育20 min，PBS洗3 min/次×3。滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶，置濕盒內(nèi)37℃溫箱內(nèi)孵育20 min，PBS洗3 min/次 ×3。DAB 顯色5～10 min，蒸餾水洗。蘇木素輕度復(fù)染，蒸餾水洗。常規(guī)脫水、二甲苯透明、樹脂膠封固，顯微鏡觀察。采用圖像分析系統(tǒng)，每組選取6張切片，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，精確選取視野內(nèi)所有陽(yáng)性顆粒，計(jì)算機(jī)自動(dòng)算出面密度。面密度就是陽(yáng)性目標(biāo)總面積和統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積之比，用于定量表達(dá)免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間方差分析用F檢驗(yàn)，有差異的組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力比較 各組大鼠潛伏期第1天、第2天無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加各組大鼠潛伏期均縮短，模型組與正常組相比潛伏期明顯延長(zhǎng)，且第6天跨越平臺(tái)的次數(shù)減少(P＜0.01);模型組與清開方組和安理申組相比有極顯著性差異(P＜0.01);與皂苷組相比，差異亦有顯著性(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠潛伏期比較(±s，s，n=8)

表1 各組大鼠潛伏期比較(±s，s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天正常組 52.52±12.02 45.39±10.40 21.28±10.992) 17.87±7.112) 15.16±9.022) 3.88±0.782)模型組 56.97±10.69 49.77±7.11 49.47±11.54 46.26±9.25 43.46±11.68 0.55±0.52清開方組 56.86±9.43 47.42±9.07 23.19±15.942) 21.39±6.792) 19.13±11.422) 2.80±1.612)安理申組 56.83±8.99 47.11±9.11 22.77±7.932) 19.24±12.522) 17.78±11.542) 2.90±1.192)皂苷組 55.76±9.50 48.06±6.93 35.55±10.841) 32.35±12.251) 29.82±12.511) 1.88±1.451)

2.2 大鼠大腦海馬區(qū)GFAP及IL-1β表達(dá)水平比較 模型組與正常組相比，大鼠海馬區(qū)GFAP表達(dá)明顯增多(P＜0.01);清開方組、皂苷組與模型組相比，海馬區(qū)GFAP表達(dá)均減少(P＜0.05);安理申組與模型組相比，海馬區(qū)GFAP表達(dá)減少(P＜0.01)。海馬區(qū)IL-1β表達(dá)清開方組與模型組比較明顯降低，(P＜0.05)，與皂苷組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2、圖1、圖 2。

2.3 大鼠海馬區(qū)Aβ、APP表達(dá)水平比較 大鼠模型組與正常組相比，海馬Aβ、APP表達(dá)均明顯增多(P＜0.01);清開方組與模型組相比，海馬Aβ、APP表達(dá)均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05);皂苷組與模型組相比，海馬 Aβ、APP表達(dá)減少(P＜0.05)。見(jiàn)表3、圖3、圖4。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)GFAP表達(dá)(SABC法，×400)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)IL-1β表達(dá)(SABC法，×400)

圖3 各組大鼠海馬區(qū)Aβ表達(dá)(SABC法，×400)

表2 大鼠海馬區(qū)GFAP、IL-1β表達(dá)水平比較(±s，n=6)

表2 大鼠海馬區(qū)GFAP、IL-1β表達(dá)水平比較(±s，n=6)

面密度正常組 0.045 2±0.006 82) 0.057 8±0.002 12)組別 GFAP面密度 IL-1β模型組 0.086 3±0.011 6 0.110 6±0.009 4安理申組 0.047 4±0.004 52) 0.093 8±0.005 21)清開方組 0.068 5±0.007 71) 0.094 1±0.007 51)皂苷組 0.071 7±0.013 01)0.104 1±0.011 1

表3 大鼠海馬區(qū)Aβ、APP表達(dá)水平比較(±s，n=6)

表3 大鼠海馬區(qū)Aβ、APP表達(dá)水平比較(±s，n=6)

面密度正常組 0.038 3±0.001 72) 0.036 6±0.008 82)組別 Aβ面密度 APP模型組 0.080 0±0.010 1 0.085 7±0.012 1安理申組 0.068 4±0.003 51) 0.042 8±0.012 02)清開方組 0.042 1±0.004 62) 0.073 2±0.008 51)皂苷組 0.069 2±0.002 41) 0.074 5±0.005 31)

圖4 各組大鼠海馬區(qū)βAPP表達(dá)(SABC法，×400)

3 討論

Aβ在腦內(nèi)沉積是AD早期的主要病理變化〔5，6〕。Aβ來(lái)源于體內(nèi)APP，含有KPI結(jié)構(gòu)的APP可能通過(guò)抑制Aβ的降解增加局部Aβ的濃度。SP中除含有淀粉樣蛋白外，還包括炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6等，提示慢性炎癥和免疫反應(yīng)參與了AD的病理過(guò)程。Aβ通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，將急性反應(yīng)轉(zhuǎn)變成慢性炎癥損傷，其機(jī)制可能是小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的受體復(fù)合物(CD36和CD47)與神經(jīng)元周圍沉積的Aβ發(fā)生相互作用，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。AD患者大腦中GFAP水平可提高8～16倍，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損傷時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性星形細(xì)胞致體積增大，出現(xiàn)GFAP增多的特征，而過(guò)量分泌促炎因子，介導(dǎo)炎癥損傷〔7〕。有研究表明IL-1β過(guò)度表達(dá)和釋放是其始動(dòng)環(huán)節(jié)，IL-1β可以上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)促炎因子，誘導(dǎo)補(bǔ)體、氧自由基、NO、β-APP等生成增加，導(dǎo)致慢性炎癥的形成和炎性產(chǎn)物的大量產(chǎn)生，各種高水平的炎性產(chǎn)物在AD病理?yè)p傷中產(chǎn)生不同的病理促進(jìn)作用，并貫穿AD病理發(fā)展的整個(gè)過(guò)程〔8〕。

本實(shí)驗(yàn)所采用方藥源自明代著名醫(yī)學(xué)家張景岳《景岳全書》中的“蠻煎”，由生地、麥冬、芍藥、石菖蒲、石斛、牡丹皮、茯神、陳皮、知母、去木通，加苦參而成，具有清心涼血開竅功效。課題組自2004年開始通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)闡釋清心開竅方治療AD的療效與機(jī)制，結(jié)果顯示，清心開竅方水煎劑能明顯改善由AlCl3灌胃導(dǎo)致癡呆的AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，降低AD小鼠腦組織中NO、NOS含量及Ache活性，降低氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷，明顯改善海馬神經(jīng)細(xì)胞的破壞〔9～12〕。

本研究在以往研究的基礎(chǔ)上采用Aβ25～35雙側(cè)杏仁核注射法，通過(guò)Aβ的毒性作用制作AD大鼠模型，以清心開竅方及其總皂苷進(jìn)行治療，結(jié)果顯示清心開竅方通過(guò)降低GFAP，減輕炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)Aβ及βAPP代謝而改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力，提示通過(guò)有效抑制腦內(nèi)炎性反應(yīng)，減少Aβ產(chǎn)生是清心開竅方治療AD的重要機(jī)制之一。由于課題經(jīng)費(fèi)和時(shí)間所限，本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本數(shù)量不夠多，觀察周期比較短，而有關(guān)清心開竅方在改善鈣代謝、抑制細(xì)胞凋亡以及提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)作用等方面的研究沒(méi)有進(jìn)行具體分析，還有待下一步深入探討。

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