趙曼曼， 崔建忠， 李 冉， 都凌杰， 田艷霞， 闞 泉， 張 娟， 高俊玲△

(1河北聯(lián)合大學基礎醫(yī)學院組胚教研室，河北省煤礦衛(wèi)生與安全實驗室，2唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000)

矽(塵)肺病是我國最為嚴重的職業(yè)衛(wèi)生問題之一，在職業(yè)病中發(fā)病率和死亡率均較高，嚴重危害我國的生產(chǎn)力和勞動人民的身體健康，成為影響社會健康持續(xù)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生和社會問題。直至目前，矽肺纖維化的發(fā)病機理尚未明確，無早期診斷的特異性指標，無特異性治療藥物和方法，不可治愈，無法逆轉。因此，尋找一種安全、有效、低毒的新型抗矽肺纖維化藥物或措施已經(jīng)成為迫切需要解決的問題。近年來，隨著干細胞研究的深入發(fā)展，以骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)為代表的干細胞移植治療在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的肺損傷、博來霉素和石棉引起的肺纖維化中有積極的效果[1]。然而，BMSCs在矽肺纖維化中是否同樣發(fā)揮作用，至今鮮有文獻報道。本實驗采用SiO2氣管內灌注法制作大鼠矽肺纖維化模型，并給予不同劑量BMSCs治療，通過觀察組織形態(tài)學改變、檢測炎癥因子及膠原蛋白表達情況，探討B(tài)MSCs外源性移植對大鼠矽肺纖維化的療效及其量效關系，為矽肺纖維化的防治研究提供一定的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 BMSCs的供體動物:選擇SPF級幼年雄性SD大鼠10只，3～6周齡，體重100～120 g;BMSCs的受體動物:選擇SPF級成年雌性SD大鼠50只，體重180～220 g，均由北京維通利華動物公司提供。

1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco;10%胎牛血清購自HyClone;0.25%胰酶購自Sigma;SiO2粉塵購自Sigma;Masson三色染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司;SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物有限公司;DAB顯色試劑盒購自北京天根生物技術有限公司;BCIP/NBT顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司;RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑購自上海貝博生物技術有限公司;PVDF膜購自Roche，Ⅰ抗羊抗鼠的多克隆抗體性別決定區(qū)Y(sex－determining region Y，SRY)蛋白及兔抗鼠的多克隆抗體腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、轉化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF －β)、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和β －actin均購自Santa Cruz;Ⅱ抗山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司;Alexa Fluor標記的熒光Ⅱ抗驢抗羊IgG購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 大鼠BMSCs的分離及培養(yǎng) 頸椎脫臼處死大鼠，無菌分離股骨和脛骨，暴露骨髓腔。用DMEM高糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1000 r/min低溫離心10 min后棄去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞。計數(shù)后按1×105/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每2～3 d換液1次。待細胞95%融合時，用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進行傳代，細胞傳至第3代用于實驗。

2.2 實驗分組及動物模型制備 將50只雌性SD大鼠隨機分為5組:(1)對照組:每只大鼠左、右支氣管內各灌注滅菌氯化鈉溶液0.5 mL;(2)矽肺模型組:每只大鼠左、右支氣管內各灌注滅菌氯化鈉溶液與SiO2粉塵混懸液(50 g/L)0.5 mL;(3)BMSCs治療A組:每只大鼠于造模成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 mL(1×109/L);(4)BMSCs治療B組:每只大鼠于造模成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 mL(3×109/L);(5)BMSCs治療C組:每只大鼠于造模成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 mL(5×109/L)。于造模后21 d處死各組大鼠取材備用。

2.3 肺組織形態(tài)學檢測 取右肺下部肺組織以質量分數(shù)為4%多聚甲醛常規(guī)固定24 h、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片。進行HE染色及Masson染色(按Masson三色染色試劑盒說明書進行操作)，光學顯微鏡下觀察。

2.4 免疫組織化學法檢測TNF－α和TGF－β 操作按SABC免疫組化試劑盒說明進行，烤片，脫蠟，滅活，抗原修復，BSA封閉，兔抗鼠的多克隆抗體4℃孵育過夜(均為 1∶50)，陰性對照用 PBS(0.01 mol/L，pH 7.3)代替Ⅰ抗孵育，山羊抗兔IgG室溫孵育30 min，SABC室溫20 min，DAB顯色。蘇木素輕度復染，中性樹膠封片。將切片用Image Pro－Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行分析，以積分吸光度(integrated absorbance value，IA)值表示，每張切片隨機選擇10個(400倍)具有代表性的相互非重疊高倍視野進行測定。

2.5 免疫印跡法檢測 TNF－α、TGF－β、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的蛋白表達量 取肺組織100 mg，加入1 mL RIPA裂解液，4 μL蛋白酶抑制劑，低溫下勻漿，10000 r/min低溫離心10 min。標準蛋白曲線測定上清蛋白濃度，進行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分離后，轉移至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉37℃封閉2 h，兔抗鼠多克隆抗體(TNF－α、TGF－β和 β－actin工作濃度:1∶500)4℃孵育過夜，山羊抗兔IgG(工作濃度:1∶3000)37℃孵育2 h。以BCIP/NBT避光顯色。將PVDF膜用掃描儀掃描后，經(jīng)ImageJ圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，以目標與內參照(β－actin)吸光度(A)值的比值作為分析對象進行比較。

2.6 免疫熒光染色法檢測SRY表達情況 留取心、肝、脾、腎、肺組織標本，經(jīng) 4%甲醛固定 24 h，入30%蔗糖溶液(0.1 mol/L PBS，pH 7.4)，浸泡至組織塊沉底，OCT包埋劑包埋，恒溫箱冰凍切片機切片(片厚15 μm)。滴加0.4%Triton －100 孵育10 min，驢血清封閉1 h，滴加SRY抗體(工作濃度:1∶200)，4℃濕盒孵育過夜，陰性對照用PBS(0.01 mol/L，pH 7.3)代替Ⅰ抗孵育，加入Alexa Fluor標記的熒光Ⅱ抗(工作濃度:1∶1000)，37℃濕盒避光孵育2 h，中性甘油封片，用激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)觀察并攝片。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 BMSCs的形態(tài)學觀察

原代細胞在48 h之內貼壁，以分散的克隆聚集方式增殖，細胞形態(tài)基本為均勻紡錘形和梭形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細胞。造血干細胞及其它細胞呈非貼壁生長，通過多次換液逐漸減少，BMSCs純化。2周后原代細胞95%融合，進行傳代。傳代后細胞度過生長抑制期，增長加速，呈現(xiàn)漩渦狀和放射狀集落生長傾向，隨著傳代次數(shù)增加，細胞形態(tài)更為均一，為梭形成纖維細胞樣。本實驗所用細胞為第3代BMSCs。依據(jù)細胞的生長特性、形態(tài)特征和前期實驗流式細胞儀檢測結果，鑒定其為BMSCs。

2 HE染色形態(tài)學檢測結果

對照組見肺泡結構清晰，肺泡壁薄，未見明顯炎細胞浸潤。矽肺模型組見肺泡間隔增寬，肺間質炎癥細胞浸潤，以巨噬細胞和淋巴細胞浸潤為主，有明顯矽結節(jié)形成。BMSCs治療A組肺泡間隔略增寬，少量炎癥細胞浸潤，矽結節(jié)少且小。BMSCs治療B組較A組的病理改變更輕。BMSCs治療C組較矽肺模型組病變程度加重，肺泡結構破壞消失，矽結節(jié)多且大，并且出現(xiàn)部分融合現(xiàn)象，見圖1。

Figure1.The morphological observation of lung tissue in each group(HE staining，×200).A:control group;B:model group;C:BMSCs A group;D:BMSCs B group;E:BMSCs C group.圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學觀察

3 Masson染色形態(tài)學檢測結果

Masson染色可見膠原纖維呈藍色，肌纖維、胞質、紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色。對照組大鼠肺間質內有少量纖細的膠原分布。矽肺模型組肺組織見大片狀密集的膠原纖維沉積，小血管壁及支氣管周圍膠原增生明顯，并向肺間質延伸，呈網(wǎng)狀或束狀。BMSCs治療A組大鼠肺組織膠原沉積明顯減少，呈小片狀或小束狀，BMSCs治療B組較A組改善情況更顯著。BMSCs治療C組較矽肺模型組肺組織膠原沉積更加致密，且結節(jié)內數(shù)量不等的膠原纖維呈同心圓排列，纖維化程度加重，見圖2。

Figure2.The collagen changes of lung tissue in each group(Masson staining，×400).A:control group;B:model group;C:BMSCs A group;D:BMSCs B group;E:BMSCs C group.圖2 各組大鼠肺組織的膠原變化

4 TNF－α和TGF－β的免疫組織化學檢測結果

TNF－α和TGF－β陽性表達產(chǎn)物為棕褐色，呈顆粒狀分布于胞漿中，顏色越深表達越強，細胞核復染呈藍色。對照組TNF－α和TGF－β陽性細胞偶見于肺泡間質。矽肺模型組見大量棕黃色陽性細胞，多數(shù)聚集在矽結節(jié)內，并主要定位于炎癥細胞和巨噬細胞的胞漿。BMSCs治療A組較矽肺模型組陽性細胞表達有下降趨勢，數(shù)量減少，強度減弱(P＜0.05)。BMSCs治療B組較A組陽性細胞數(shù)量和強度減少減弱更加明顯(P＜0.05)。BMSCs治療C組較矽肺模型組陽性細胞數(shù)量略增多，表達強度略增強(P ＞0.05)，見圖3、4和表1。

Figure3.The expression of TNF－α protein of lung tissue in each group(immunohistochemical staining，×400).A:control group;B:model group;C:BMSCs A group;D:BMSCs B group;E:BMSCs C group.圖3 各組大鼠肺組織TNF－α蛋白表達

Figure4.The expression of TGF－β protein of lung tissue in each group(immunohistochemical staining，×400).A:control group;B:model group;C:BMSCs A group;D:BMSCs B group;E:BMSCs C group.圖4 各組大鼠肺組織TGF－β蛋白表達

表1 各組大鼠肺組織TNF－α和TGF－β蛋白的表達Table1.The expression of TNF－α and TGF－β proteins of lung tissue in each group(IA..n=10)

表1 各組大鼠肺組織TNF－α和TGF－β蛋白的表達Table1.The expression of TNF－α and TGF－β proteins of lung tissue in each group(IA..n=10)

*P ＜0.05 vs control group;▲P ＜0.05 vs model group;★P ＜0.05 vs BMSCs A group.

Protein Control Model BMSCs A BMSCs B BMSCs C TNF － α 14.83 ±1.68 45.87 ±3.18* 30.84 ±2.36▲＊ 20.84 ±2.23▲★＊ 49.05 ±3.36*TGF － β 14.31 ±1.42 41.93 ±2.89* 27.05 ±2.16▲＊ 19.52 ±2.06▲★＊ 43.85 ±3.24*

5 免疫印跡法檢測TNF－α、TGF－β、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原結果

對照組TNF－α、TGF－β、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原僅有少量基礎表達。矽肺模型組較模型對照組其蛋白表達明顯增強(P＜0.05)。BMSCs治療A組較矽肺模型組蛋白表達明顯減弱(P＜0.05)，BMSCs治療B組較A組蛋白表達減弱更加顯著 (P＜0.05)，但仍高于對照組表達量，BMSCs治療C組較矽肺模型組蛋白表達略增強(P＞0.05)，見圖5。

Figure5.The expression of TNF－α，TGF－β，collagenⅠand collagenⅢproteins in lung tissues..n=10.*P＜0.05 vs control group;▲P ＜0.05 vs model group;★P＜0.05 vs BMSCs A group.1:control group;2:model group;3:BMSCs A group;4:BMSCs B group;5:BMSCs C group.圖5 各組大鼠 TNF－α、TGF－β、collagenⅠ和 collagenⅢ蛋白的表達

6 SRY的免疫熒光法檢測結果

SRY陽性表達產(chǎn)物為綠色熒光，分布于胞核中。BMSCs治療B組的心、肝、脾、腎、肺組織熒光染色切片在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀測結果示:心、脾組織中未見綠色熒光，肝、腎組織中見微量綠色熒光(BMSCs在血流豐富器官瘀滯所致)，肺組織中見大量綠色熒光呈散點狀分布，見圖6。

討 論

Figure6.The expression of SRY of different organs in BMSCs B group(immunofluorescence，×400).A:heart;B:liver;C:spleen;D:kidney;E:lung.圖6 BMSCs治療B組大鼠心、肝、脾、腎、肺組織中SRY表達

矽肺纖維化的損傷機制復雜，且損傷后的逆轉需要多角度、多環(huán)節(jié)、多靶標的干預策略，至今臨床上尚無明確有效的治療方法。目前鑒于對矽肺發(fā)生后組織異常修復的認識，使得BMSCs在肺損傷中的角色逐漸引起生命科學界的關注。BMSCs是來源于骨髓的一種多能干細胞，具有高度自我更新和多方向分化的潛能(可分化為脂肪細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、神經(jīng)細胞和內皮細胞等多種組織細胞類型);還可感知損傷信號，遷移至損傷區(qū)，發(fā)揮修復和再生的能力[2];并且具有較強的免疫調節(jié)功能，進行異體移植時可避免免疫排斥反應[3];除此之外，BMSCs具有旁分泌功能，可生成多種細胞因子，促進血管再生及損傷修復[4]。因此，BMSCs已經(jīng)成為具有廣泛應用前景的各種疾病的細胞與基因治療來源。近幾年來，較多研究者不僅在動物損傷模型(腦損傷、心肌損傷、脊髓損傷、骨損傷等)中證實明BMSCs的療效，還在諸多器官纖維化疾病中發(fā)現(xiàn)BMSCs能夠減輕膠原沉積，防治靶器官纖維化，在臨床上具有巨大的潛在應用價值。正如Zheng等[5]證實BMSCs可抑制二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導的小鼠肝纖維化的形成，并發(fā)現(xiàn)BMSCs在一定的微環(huán)境誘導下可分化為肝細胞，修復肝損傷，恢復肝功能，降低肝纖維化。同年Lan等[6]證實移植BMSCs可下調肝纖維化大鼠炎癥反應，促進肝再生，抑制活化肝星狀細胞，改善肝臟病理組織學和肝功能。此外，BMSCs還被廣泛用于治療急慢性心肌梗死，拮抗心肌纖維化。BMSCs可以轉化為心肌細胞參與心肌收縮、改善梗死區(qū)血運、抑制心室重構，最終促進心肌梗死后心功能的恢復[7]，并可通過旁分泌機制，減少心梗面積，增強心肌梗死的修復[8]。

總之，BMSCs為器官纖維化的防治提供了一條嶄新的思路，同時也給肺纖維化的防治帶來了希望。然而，BMSCs在肺領域的應用研究落后于其它器官，主要由于肺組織細胞來自多胚層、結構功能復雜，所以目前尚處于動物實驗階段。有研究者將BMSCs注入博來霉素所致的肺纖維化動物模型后，發(fā)現(xiàn)其可向肺部移行，具有明顯趨化移居傾向，并且可分化為肺泡上皮細胞和血管內皮細胞等，參與損傷肺組織的修復重建[9]。盡管BMSCs在矽肺纖維化中的應用至今鮮有文獻報道，但如上所述為我們的設想提供了現(xiàn)實可行的依據(jù)。

本次實驗以此為基礎展開，為了更好的示蹤BMSCs在體內聚集、存活及分布狀況，提取雄性幼鼠的BMSCs注入雌性成年大鼠體內，通過監(jiān)測SRY的表達示蹤BMSCs情況。有關移植時間窗的選擇，我們參照 Ortiz等[10]及 Cui等[11]的研究結果，損傷后早期進行BMSCs輸注有顯著的治療效果，這與肺內損傷部位微環(huán)境隨病程發(fā)展變化有關，因此在矽肺模型制備成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs進行治療。形態(tài)學結果顯示:BMSCs移植治療后，肺間質炎癥細胞浸潤減少、矽結節(jié)的數(shù)量及大小減少減小、膠原沉積及纖維化程度減輕。提示BMSCs可減緩矽肺纖維化的病理進程，推測可能通過BMSCs向II型肺泡上皮細胞分化，在一定程度上恢復和重建肺泡上皮細胞池，使之不至于被耗盡，增加肺泡上皮細胞的來源，不斷替代已破壞的細胞，促進組織修復，維持肺組織結構和功能的完整性。TNF－α和TGF－β是肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages，AM)吞噬粉塵后釋放的主要致炎致纖維化因子，在矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原可代表晚期膠原的沉積情況，反映纖維化程度。這些可作為觀測BMSCs治療矽肺纖維化療效的指標。免疫組織化學及免疫印跡結果顯示:BMSCs可下調TNF－α、TGF－β、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達，其可能機制是BMSCs旁分泌白細胞介素－1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL1RN)[12]、TNF－α拮抗劑[10]等細胞因子，來減少炎癥因子的產(chǎn)生及阻斷導致纖維化的信號通路，發(fā)揮抗炎/抗纖維化的作用。那么此療效與移植細胞的數(shù)量是否有關聯(lián)，我們將進一步探討。實驗中在BMSCs治療組設3個劑量梯度，結果顯示中劑量組較低劑量組的治療效果顯著，高劑量組不但沒有起到治療作用反而加重病情，其具體機制未明，可能由于過量的BMSCs在體內微環(huán)境的調控下分化為肌成纖維細胞和成纖維細胞[13]，加重矽肺纖維化程度。由此推斷BMSCs治療矽肺纖維化需要合適的細胞數(shù)量，療效與劑量之間并非正比直線關系。其具體的機制還有待進一步研究證實。

綜上所述，本研究證實了BMSCs對矽肺纖維化有積極的治療效果，可緩解并部分逆轉肺纖維化的病理狀態(tài)、減輕炎癥反應、抑制晚期膠原沉積、拮抗纖維化的發(fā)生，促進肺組織損傷后的修復重建，且此療效與移植細胞數(shù)量相關。為BMSCs面向臨床的應用提供理論和實驗依據(jù)，對預防、治療乃至最終消除矽肺具有重要的經(jīng)濟和社會意義。

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