鄒 豐， 王緒明， 劉麗江△

(1江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，湖北 武漢430056;2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430071)

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，男性胃癌的人數(shù)明顯多于女性胃癌，女性胃癌的發(fā)生時間要比男性晚10 ～15 年，且絕經(jīng)期后發(fā)病率與男性基本相同，提示胃癌的發(fā)生與雌激素及其受體(estrogen receptor，ER)的作用有關(guān)［1］。ER 至少包括在細(xì)胞核或細(xì)胞膜表達(dá)的α 和β 2 個亞型。其中ER-α 除了參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡外，也在冠心病及某些惡性腫瘤(如乳腺癌、結(jié)腸癌等)的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體ER -α66 的同源異構(gòu)體ER -α36 介導(dǎo)胃癌的生長［3］，其機(jī)制并不清楚。

MicroRNA 是近幾年被證明的一類高度保守的內(nèi)源性非蛋白編碼的小分子單鏈RNA，長度約為20 ～25 nt。MicroRNA 的主要功能是通過對靶基因轉(zhuǎn)錄體的切割或?qū)ζ浞g抑制來調(diào)控基因的表達(dá)［4］。有文獻(xiàn)報道m(xù)iR -143 在胃癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)［5］，miR-143 與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。miR -143 與ER-α36 是否介導(dǎo)了胃癌的侵襲及其可能的機(jī)制并無文獻(xiàn)報告，本項研究旨在探討這一點。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞系SGC7901 由武漢科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系惠贈，為本實驗室保存。

1.2 主要試劑 17β -雌二醇(17β -estradiol，E2)和TRIzol 購自Sigma;ER -α36 沉默質(zhì)粒、ER -α36過表達(dá)質(zhì)粒和ER - α36 單克隆抗體均由美國Creighton 大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥中心王兆一教授饋贈;actin 抗體購自Santa Cruz;Transwell 侵襲試劑盒購自Millipore;miR-143、內(nèi)參照U6 的Taqman 引物和探針均購自Applied Biosystems。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC7901 細(xì)胞接種在含10%小牛血清的RPMI -1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 ～3 d 待細(xì)胞增長至約70 ～80%左右融合時胰酶消化傳代。E2分為低濃度(1 ×10-10mol/L)和高濃度(5 ×10-6mol/L)組，處理細(xì)胞的時間為12 h。

2.2 Transwell 侵襲實驗 SGC7901 細(xì)胞的侵襲實驗采用試劑盒的方法:向侵襲小室(Transwell chamber)中加入制備好的密度為(0.5 ～1.0)×109/L 的無血清細(xì)胞懸液。將小室置于含10%胎牛血清培養(yǎng)基的24 孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h。用棉簽輕輕刮除小室內(nèi)未侵襲的細(xì)胞后，將小室底部置于試劑盒中的染色液里染色20 min。漂洗數(shù)次、風(fēng)干。在顯微鏡下觀察，細(xì)胞計數(shù)。

2.3 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染低表達(dá)ER-α36 和高表達(dá)ERα36 的SGC7901 細(xì)胞系 按照王兆一教授提供的ER-α36 有效靶序列設(shè)計合成單鏈寡聚DNA 重組慢病毒ER -α36 沉默質(zhì)粒(pLKO.1 - PURO - SP6-ER-α36 -L)和ER -α36 過表達(dá)質(zhì)粒(pLJM1 -ER-α36 - H)。ER - α36 上游引物5'- CCGGTTGATGCCAATAGGTACTGAACTCGAGTTCAGTACCTATTGGCATCAATTTTTTG - 3'，下 游 引 物5' - AATTCAAAAAATTGATGCCAATAGGTACTGAACTCGAGTTCAGTACCTATTGGCATCAA-3'。經(jīng)單鏈退火反應(yīng)后獲得雙鏈寡聚物。將雙鏈寡聚物連接到pLKO.1-PURO-SP6 載體(Age I/EcoR I)上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli XL-blue 感受態(tài)細(xì)胞，挑取6 個單克隆進(jìn)行PCR 鑒定。1%凝膠電泳檢測，300 bp 條帶為陽性克隆，2 kb 條帶為陰性克隆。選取陽性克隆用Tiangen 小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，U6 的引物為5'-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG -3'。接著構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系:以Lipofectamine 2000TM細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒將pLKO.1-PURO-SP6 - ER-α36 -L 和pLJM1 - ER-α36-H 轉(zhuǎn)染給包裝細(xì)胞293T 細(xì)胞，收集293T 細(xì)胞的病毒懸液并感染SGC7901 細(xì)胞，SGC7901 細(xì)胞長滿后按1∶10傳代，用嘌呤霉素篩選，最終得到pLKO.1-PURO-SP6 -ER -α36 -L(ER -α36 low group)和pLJM1 - ER-α36 -H(ER-α36 high group)的穩(wěn)定細(xì)胞株。同時建立空載體轉(zhuǎn)染SGC7901 細(xì)胞系pLKO.1 -PURO -scrambled shRNA(ER - α36 control group)。Western blotting 鑒定重組細(xì)胞ER-α36的表達(dá)。

2.4 Western blotting 檢測 提取細(xì)胞胞漿總蛋白，按BCA 蛋白含量測定試劑盒說明進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE 后蛋白半干轉(zhuǎn)印于PVDF 膜，封閉后I抗分開孵育:分別加入ER-α36 抗體和actin 抗體，4℃過夜;洗膜后孵育II 抗，室溫1 h，洗膜后于暗室中行ECL 顯色檢測蛋白的表達(dá)，采用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描測定ER-α36 和內(nèi)參照actin 的表達(dá)(用平均吸光度值表示)。

2.5 MicroRNA 測序 2 株SGC7901 重組細(xì)胞系(ER-α36 low group 和ER-α36 high group)和對照組SGC7901 系(ER -α36 control group)送至深圳華大基因研究院進(jìn)行microRNA 測序。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 高濃度、低濃度E2 對SGC7901 細(xì)胞侵襲性和ER－α36 表達(dá)的影響

與對照組SGC7901 細(xì)胞(7901 control)相比，高濃度E2刺激下的SGC7901 細(xì)胞(7901 +low E2)的侵襲性明顯減弱，而低濃度E2刺激下的SGC7901 細(xì)胞(7901 + high E2)的侵襲性明顯增強，見圖1。Western blotting 結(jié)果顯示，高濃度E2刺激SGC7901細(xì)胞后，ER - α36 的蛋白表達(dá)要明顯低于對照組SGC7901 細(xì)胞組，但這種效應(yīng)在低濃度E2刺激后則為相反，見圖2。

2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染低表達(dá)ER－α36 和高表達(dá)ER－α36 的SGC7901 細(xì)胞系的構(gòu)建

對構(gòu)建好的2 株重組細(xì)胞系進(jìn)行Western blotting 檢測結(jié)果顯示，高表達(dá)ER -α36 的SGC7901 細(xì)胞組(ER-α36 high)，其ER -α36 蛋白表達(dá)要明顯高于對照的SGC7901 細(xì)胞組(ER -α36 control)，低表達(dá)ER-α36 的SGC7901 細(xì)胞組(ER-α36 low)的ER-α36 蛋白表達(dá)要明顯低于對照組SGC7901 細(xì)胞組(ER-α36 control)，提示重組細(xì)胞系構(gòu)建成功，見圖3。

Figure 1. The changes of the invasion ability of SGC7901 cells treated with high or low concentration of 17β-estradiol (×10).圖1 低濃度、高濃度E2 刺激胃癌SGC7901 細(xì)胞后侵襲能力的變化

Figure 2. The expression of ER-α36 in SGC7901 cells treated with high or low concentration of 17β-estradiol. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs 7901 control group.圖2 高濃度、低濃度E2 刺激胃癌SGC7901 細(xì)胞后ER－α36 蛋白的表達(dá)

Figure 3. The SGC7901 cells with stable low expression and high expression of ER-α36 were successfully constructed. ±s.n=5.* P ＜0.05 vs ER-α36 control group.圖3 低表達(dá)ER－α36 和高表達(dá)ER－α36 的SGC7901 胃癌細(xì)胞株構(gòu)建成功

3 ER－α36 對SGC7901 細(xì)胞侵襲的影響

與普通SGC7901 細(xì)胞組(ER - α36 control)相比，高表達(dá)ER -α36 的SGC7901 細(xì)胞組(ER -α36 high)侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而低表達(dá)ER-α36 的SGC7901 細(xì)胞組(ER -α36 low)侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖4。這提示ER -α36 的表達(dá)與腫瘤的侵襲呈正相關(guān)。

Figure 4. The changes of the invasion ability of SGC7901 cells with stable low expression and high expression of ER-α36 (×10).圖4 低表達(dá)ER－α36 和高表達(dá)ER－α36 的胃癌SGC7901 細(xì)胞侵襲能力的變化

4 miR－143 表達(dá)與ER－α36 表達(dá)的關(guān)系

與普通SGC7901 細(xì)胞(ER -α36 control group)相比，高表達(dá)ER -α36 的SGC7901 細(xì)胞(ER -α36 high group)miR -143 表達(dá)顯著下調(diào)，低表達(dá)ER -α36 的SGC7901 細(xì)胞(ER - α36 low group)miR -143 表達(dá)則顯著上調(diào)，見圖5。

Figure 5. The expression of miR-143 was significantly decreased in the SGC7901 cells with stable high expression of ER-α36 and was increased in the SGC7901 cells with stable low expression of ER-α36. ＊＊P ＜0.01 vs ER-α36 control group.圖5 miR－143 在不同ER－α36 表達(dá)的胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)

討 論

ER 在胃癌中的作用機(jī)制研究可以追溯到上個世紀(jì)，但一直未取得突破性的進(jìn)展。1986 年首次發(fā)現(xiàn)ER 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)，其陽性率約50%，尤以ER - α66 的陽性表達(dá)受到重視［7］。近年的研究發(fā)現(xiàn)，ER - α 至少包括ER - α66、ER - α46 和ER -α36［8］，其中ER-α46 和ER -α36 的主要功能作用并不清楚。但有研究證實，ER -α36 的表達(dá)不完全依賴于ER-α66，并可經(jīng)細(xì)胞膜啟動雌激素類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［9-10］。

我們的前期研究工作發(fā)現(xiàn):人胃癌細(xì)胞系(BGC-823、AGS、MKN -45 和SGC -7901)均能在mRNA、蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)定位的不同層面表達(dá)ER -α36蛋白，并且對雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(tamoxifen)以及雌激素受體特異性阻斷劑(ICI 182780)產(chǎn)生應(yīng)答;ER-α36 蛋白在人體胃癌組織中也呈高表達(dá)［3］。本研究通過用高劑量或低劑量的17β-雌二醇刺激SGC7901 人胃癌細(xì)胞，以模擬絕經(jīng)前女性或男性的雌激素環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量的17β-雌二醇可以增加ER - α36 蛋白的表達(dá)，增強SGC7901 細(xì)胞的侵襲能力，而高劑量的17β-雌二醇刺激細(xì)胞后的效應(yīng)相反。因此，為解釋絕經(jīng)前女性的胃癌發(fā)病率明顯低于男性的臨床現(xiàn)象提供了一定的實驗證據(jù)，也為從理論上闡述高雌激素的保護(hù)作用提供了支持，而高雌激素的保護(hù)主要是通過ER -α36 介導(dǎo)的，并且與胃癌的生長和侵襲密切相關(guān)。

現(xiàn)階段大量文獻(xiàn)報道，microRNA 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的功能大概類似于癌基因或抑癌基因，幾乎參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的每一步過程，因此在腫瘤診斷、治療等方面具有很好的應(yīng)用前景［11］。miR -143 位于人類基因組5 號染色體上，現(xiàn)階段已證實與多種腫瘤存在聯(lián)系。miR -143 在不同腫瘤中表達(dá)并不完全一致:在肝癌中高表達(dá)［12］，在結(jié)腸癌或肺癌中低表達(dá)［13-14］，并且與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1 以及結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。有研究顯示，miR-143 在胃癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，并在區(qū)分胃癌的分化度方面有較好的敏感性和特異性［5］。但與胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系如何，未見報道。我們通過測序的方法發(fā)現(xiàn)，與ER-α36 表達(dá)密切相關(guān)的microRNA 是miR-143，即高表達(dá)ER -α36 的SGC7901 細(xì)胞miR -143 表達(dá)顯著下調(diào)，而低表達(dá)ER -α36 的SGC7901細(xì)胞miR -143 表達(dá)顯著上調(diào)。因此，我們推測ER-α36 介導(dǎo)胃癌的侵襲有可能受到miR -143 的調(diào)控。但miR-143 調(diào)控ER -α36 的表達(dá)以及還有哪些相關(guān)靶基因參與胃癌侵襲的過程，還需進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示:低濃度的雌激素促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲，高濃度的雌激素抑制胃癌細(xì)胞的侵襲。胃癌的侵襲能力和雌激素受體ER - α36的表達(dá)呈正相關(guān)，其機(jī)制可能與miR-143 的調(diào)控有關(guān)。

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