許林鋒，倪嘉延，陳耀庭，孫宏亮，吳裕丹

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1介入放射科，2血液科，廣東 廣州 510120)

缺氧誘導(dǎo)因子 1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF－1α)是由 Semenza等[1]于1992 年在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。HIF－1由HIF－1α和HIF－1β 2個(gè)亞基組成，HIF－1α決定HIF－1的活性。HIF－1α在惡性腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演重要的角色，是腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧適應(yīng)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。p27蛋白為細(xì)胞周期的重要負(fù)性調(diào)控因子，可最直接地影響檢查點(diǎn)的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖活性[2]。Ki67蛋白是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核杭原，Ki67標(biāo)記指數(shù)能可靠地反映正常和病變組織的增殖活性，對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有預(yù)測(cè)作用[3]。本研究探討大鼠肝癌CBRH－7919細(xì)胞在缺氧環(huán)境下，HIF－1α基因沉默對(duì)p27和Ki67表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響。

材料和方法

1 材料

大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH－7919由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。RPMI－1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen;NC膜購(gòu)自Pall;HIF－1α抗體購(gòu)自Santa Cruz;p27和Ki67抗體購(gòu)自CST;β－actin抗體購(gòu)自博士德公司;TRIzol試劑購(gòu)自TaKaRa;RT－PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa;HIF－1α和β－actin引物用Primer 3軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CBRH－7919細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)、傳代。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞消化下來(lái)以(8～10)×104/L密度接種于6孔板于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入150 μmol/L CoCl2溶液，用于模擬腫瘤內(nèi)部缺氧環(huán)境。

2.2 HIF－1α siRNA載體的構(gòu)建 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究，選擇GenBank中大鼠HIF－1α基因編碼區(qū)序列作為分析序列。采用RNAdraw分析軟件對(duì)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后按照Elbashir等推薦的siRNA設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，并篩選出一條HIF－1α靶核苷酸序列(靶mRNA)。P1:5’－GAAACUCUUCCAAGCAAUUtt－ 3’，P2:5’ － AAUUGCUUGGAAGAGUUUCtt－3’，參照siRNA的基本設(shè)計(jì)原理選擇靶序列，針對(duì)目的基因的序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)的siRNA表達(dá)載體核苷酸鏈，即HIF－1α siRNA特異性干擾序列。將siRNA溶液與脂質(zhì)體LipofectamineTM2000載體試劑混合，形成siRNA/LipofectamineTM2000載體復(fù)合物。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 6孔板種植細(xì)胞(8～10)×104/L，在含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞匯合度達(dá)到30% ～50%。將稀釋好的HIF－1α siRNA和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000載體試劑混合，形成 HIF－1α siRNA/LipofectaminTM2000復(fù)合物。將HIF－1α siRNA轉(zhuǎn)染載體加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中融合，然后放入37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后換含10%血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，20 h恢復(fù)生長(zhǎng)后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染分組:(1)空白對(duì)照組:僅加入LipofectamineTM2000試劑。(2)轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染HIF－1α siRNA序列入細(xì)胞。

2.4 Real－time RT－PCR檢測(cè) TRIzol法提取6孔板內(nèi)各組細(xì)胞的總RNA并定量;各樣本取2 ng～2 μg總RNA，按TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用real－time RT－PCR檢測(cè)，βactin作為內(nèi)參照。PCR引物，HIF－1α正義鏈ACTGCACAGGCCACATTCAT，反義鏈CGAGGCTGTGTCGACTGAGA;β－actin正義鏈 CCTAGGCACCAGGGTGTGAT，β－actin反義鏈 TTGGTGACAATGCCGTGTTC。反應(yīng)體系為20 μL總體系，反應(yīng)條件95℃ 3 min預(yù)變性，95℃ 10 s，55℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)，并在每個(gè)循環(huán)延伸末端點(diǎn)收集熒光信號(hào)，繪制擴(kuò)增曲線。

2.5 Western blotting檢測(cè) 冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收獲蛋白。將抽提蛋白用BCA法定量后，于100 V泳道進(jìn)行SDS－PAGE;電泳結(jié)束后，以30 mA、120 min將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜;封閉液(5%BSA/TBST)封閉60 min，加入Ⅰ抗(1∶3000稀釋)4℃過(guò)夜，Ⅱ抗(1∶6000稀釋)室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次后用ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡，并進(jìn)行圖像分析。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶收集處理后的細(xì)胞，800 r/min離心10 min，沉淀采用300 μL PBS重懸，逐滴加入700 μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇中，乙醇終濃度為70%，4℃避光固定過(guò)夜。800×g離心10 min，去上清。PBS洗2次。重懸細(xì)胞于500 μL含1×105U/L RNase的PBS緩沖液中，避光，37℃孵育30 min。加2 g/L PI至終濃度50 mg/L，避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間采用t檢驗(yàn)，多個(gè)不同處理組組內(nèi)、組間計(jì)量資料的比較應(yīng)用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺氧條件下肝癌細(xì)胞HIF－1α的表達(dá)

CBRH－7919細(xì)胞經(jīng)150 μmol/L CoCl2處理12 h后，HIF－1α mRNA表達(dá)量較常氧培養(yǎng)組顯著增高(P＜0.05);24 h后細(xì)胞HIF－1α mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增加(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。CBRH－7919細(xì)胞HIF－1α蛋白的表達(dá)也呈顯類似規(guī)律，見(jiàn)圖2。

Figure1.Expression HIF－1α mRNA in hepatoma cells 24 h after treatment with CoCl2.A:real－time RT－PCR amplification curves of HIF－1α and β－actin under hypoxia;B:the change of HIF－1α mRNA expression in hepatoma cells..n=3.*P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖1 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后HIF－1α mRNA的表達(dá)

Figure2.Expression of HIF－1α protein in hepatoma cells treated with CoCl2for 24 h..n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 肝癌細(xì)胞HIF－1α蛋白的表達(dá)

2 siRNA干擾對(duì)HIF－1α表達(dá)的影響

在150 μmol/L CoCl2作用下，轉(zhuǎn)染HIF －1α siRNA表達(dá)載體后HIF－1α mRNA表達(dá)明顯減少，見(jiàn)圖3，同步檢測(cè)顯示，HIF－1α蛋白表達(dá)亦受到明顯抑制，見(jiàn)圖4，與對(duì)照組比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 沉默HIF－1α對(duì)p27表達(dá)的影響

150 μmol/L CoCl2處理和轉(zhuǎn)染 HIF －1α siRNA表達(dá)載體后，p27蛋白表達(dá)較未轉(zhuǎn)染HIF－1α siRNA表達(dá)載體的對(duì)照組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure3.The change of the mRNA expression of HIF－1α after HIF－1α siRNA transfection.A:real－time RTPCR amplification curves of HIF －1α;B:the mRNA expression of HIF－1α..n=3.*P＜0.05 vs control.圖3 HIF－1α siRNA干擾后肝癌細(xì)胞HIF－1α mRNA表達(dá)的變化

4 沉默HIF－1α對(duì)Ki67表達(dá)的影響

150 μmol/L CoCl2處理和轉(zhuǎn)染 HIF －1α siRNA表達(dá)載體后，Ki67蛋白表達(dá)較未轉(zhuǎn)染HIF－1α siRNA表達(dá)載體的對(duì)照組顯著減少，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure4.The protein expression of HIF －1α，p27 and Ki67 after the transfection of HIF－1α siRNA..n=3.*P ＜0.05 vs control.圖4 HIF－1α siRNA干擾后HIF－1α、p27和Ki67蛋白表達(dá)的變化

5 沉默HIF－1α對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，HIF－1α siRNA轉(zhuǎn)染組各期細(xì)胞分布為:G0/G1期68.7%，S期17.5%，G2/M期13.8%，而未轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體的對(duì)照組各期細(xì)胞分布為:G0/G1期51.4%，S期32.7%，G2/M期15.9%。這表明HIF－1α siRNA能有效阻滯細(xì)胞于G0/G1期，進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的G0/G1期和S期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

討 論

惡性腫瘤組織內(nèi)部長(zhǎng)期處于相對(duì)缺氧的微環(huán)境，可誘導(dǎo)HIF－1α的表達(dá)增加、降解減少。HIF－1α是腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧適應(yīng)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，可上調(diào)多種靶基因的表達(dá)，使腫瘤對(duì)相對(duì)缺氧的微環(huán)境發(fā)生適應(yīng)性改變。HIF－1α極不穩(wěn)定，易被蛋白酶降解，常氧條件下半衰期較短，但在缺氧時(shí)顯著延長(zhǎng)[4]。

Figure5.Effect of HIF －1α silencing on cell cycle of hepatoma cells detected by flow cytometry.圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HIF－1α siRNA干擾后肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期的變化

根據(jù)以往學(xué)者相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)，應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，轉(zhuǎn)染特異性siRNA于腫瘤細(xì)胞，可以有效沉默細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。鑒于HIF－1α在惡性腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵作用，本研究利用CoCl2建立缺氧模型，模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)部相對(duì)缺氧的微環(huán)境，并轉(zhuǎn)染特異性HIF－1α siRNA于大鼠肝癌CBRH－7919細(xì)胞。結(jié)果顯示，缺氧環(huán)境下HIF－1α的表達(dá)顯著增加;特異性siRNA干擾腫瘤細(xì)胞后，HIF－1α和Ki67的表達(dá)明顯減少，p27的表達(dá)顯著增加。這表明沉默HIF－1α在顯著抑制Ki67表達(dá)的同時(shí)，明顯促進(jìn)了p27的表達(dá)。于此同時(shí)，肝癌細(xì)胞的增殖亦受到一定程度的抑制。

RNA干擾可以形象地稱為基因沉默，是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來(lái)病毒侵犯的防御機(jī)制，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制范疇[5]，能特異性地封閉一個(gè)或多個(gè)基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，減少非特異作用引起的副作用，是極富有前途的治療手段。目前采用特異性siRNA沉默HIF－1α，探討肝癌細(xì)胞中增殖相關(guān)因子表達(dá)變化的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見(jiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)HIF－1α基因沉默后，增殖相關(guān)因子p27蛋白的表達(dá)明顯增多的同時(shí)Ki67蛋白的表達(dá)卻顯著減少。p27為細(xì)胞周期的重要負(fù)性調(diào)控因子，可最直接地影響限制點(diǎn)的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖活性。相關(guān)研究顯示p27的表達(dá)量和肝細(xì)胞肝癌的惡性程度及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6－7]。Ki67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核杭原，其標(biāo)記指數(shù)能可靠的反映正常和病變組織的增殖活性，與肝細(xì)胞肝癌的病理特征及預(yù)后密切相關(guān)[8]。因此，沉默HIF－1α可能通過(guò)改變?cè)鲋诚嚓P(guān)因子的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)亦發(fā)生改變。

HIF－1α在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中亦起著關(guān)鍵的作用。相關(guān)研究表明，HIF－1α在多個(gè)層次調(diào)節(jié) VEGF的表達(dá)，其主要功能包括增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性與增加VEGF mRNA穩(wěn)定性兩個(gè)方面[9]。VEGF是最早被發(fā)現(xiàn)的可被缺氧環(huán)境誘導(dǎo)生成并促進(jìn)腫瘤新生血管生成的生長(zhǎng)因子[10－11]。HIF－1α通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤新生血管的生成，與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由此可見(jiàn)，利用siRNA干擾技術(shù)沉默腫瘤細(xì)胞HIF－1α的表達(dá)，可能對(duì)控制腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移起到重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究尚存在著一定的局限性。應(yīng)用特異性siRNA干擾技術(shù)沉默靶基因的表達(dá)，已有不少成功案例;但是截至目前為止siRNA干擾技術(shù)依然應(yīng)用于離體實(shí)驗(yàn)階段，在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床應(yīng)用中，特異性siRNA干擾、沉默靶基因的功效如何，以及特異性siRNA載體的恰當(dāng)選用，仍需要進(jìn)一步的探索與證實(shí)。

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