劉 嬋， 商黔惠，△， 閔曉強(qiáng)， 陳劍玲， 毛萬姮

(遵義醫(yī)學(xué)院1臨床醫(yī)學(xué)研究所，2附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義563000)

高鹽是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的重要環(huán)境因素之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)每天多進(jìn)食100 mmol/L NaCl 可增加腦卒中、冠心病及心血管疾病發(fā)生率［1］。長(zhǎng)期高鹽飲食不僅導(dǎo)致血壓升高，而且有獨(dú)立于血壓之外的多重作用，可直接導(dǎo)致血管、心臟及腎臟等組織器官纖維化［2－4］，但其機(jī)制尚未完全明了。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因子之一，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，抑制降解細(xì)胞外基質(zhì)酶的活性［5］，參與了包括高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病過程，與血管重構(gòu)有著密切的關(guān)系。TGF－β1/Smads 信號(hào)通路是血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)、醛固酮(aldosterone，ALD)、炎癥因子等所致器官纖維化的共同通路，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分化、增殖及膠原合成，TGF－β1通過其受體及下游的胞內(nèi)效應(yīng)分子Smad 蛋白家族實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞生物功能的細(xì)胞膜到細(xì)胞核的信息傳遞。高鹽可使組織局部腎素－ 血管緊張素系統(tǒng)(renin－angiotensin system，RAS)激活，誘導(dǎo)高血壓大鼠動(dòng)脈組織血管緊張素Ⅱ1 型(angiotensinⅡtype 1，AT1)受體密度和mRNA 表達(dá)增加、動(dòng)脈壁增厚和膠原沉積［6－8］。已有研究表明，給予AngⅡ可促進(jìn)腎臟，心臟TGF－β1的產(chǎn)生和激活，AT1受體拮抗劑(angiotensin receptor blocker，ARB)能抑制其過表達(dá)［9］。TGF－β1除通過Smad 通路，也通過介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)等通路傳遞信號(hào)至細(xì)胞核內(nèi)［10］。Wang等［11］和Tharaux 等［12］證實(shí)ERK 阻斷劑影響AngⅡ介導(dǎo)的Ⅰ型膠原合成從而緩解血管纖維化，TGF－β1介導(dǎo)的ERK 通路與血管重構(gòu)關(guān)系密切，絲裂原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)超家族能通過與TGF－β1/Smads 通路的交互通話影響Smads 活性參與血管纖維化過程［13－14］。但TGF－β1/Smads 與ERK 信號(hào)通路在高鹽飲食致血管重構(gòu)中的作用及相互影響尚未完全明了。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)TGF－β1/Smads 與ERK 信號(hào)通路中關(guān)鍵性信號(hào)分子表達(dá)的研究，進(jìn)一步探討高鹽飲食引發(fā)血管重構(gòu)的機(jī)制及ARB 干預(yù)的效應(yīng)。

材 料 和 方 法

1 材料

雄性Wistar 大鼠由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK－(渝)2007－005;含NaCl 分別為0.5%和8%的顆粒飼料購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK－(粵)2008－0002;替米沙坦由海南賽力克藥業(yè)有限公司惠贈(zèng);TGF－β1、磷酸化Smad2/3(phospho－Smad2/3，p－Smad2/3)和Smad7Ⅰ抗購(gòu)自Santa Cruz，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和磷酸化ERK1/2 (phospho－ERK1/2，p－ERK1/2)Ⅰ抗購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，濃縮型DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Trizol 試劑購(gòu)自Invitrogen，Qiagen RNeasy mini kit(Qiagen)。

2 方法

2.1 模型的建立及分組 Wistar 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3 組:正常對(duì)照組(C 組)13 只，高鹽模型組(M 組)24 只，替米沙坦干預(yù)組(T 組)13 只。C 組飼以正常鹽飼料(0.5%NaCl)，M 組飼以8%高鹽飼料，T 組飼以8%高鹽飼料，同時(shí)給予替米沙坦灌胃，替米沙坦起始劑量2 mg/kg，隨后根據(jù)血壓情況每2 周調(diào)整1 次劑量，使血壓盡量控制在正常范圍內(nèi)，替米沙坦最大劑量至40 mg/kg。各組大鼠均在相同標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲用自來水，飼養(yǎng)24周。

2.2 血壓測(cè)定 用BESN－Ⅱ多通道動(dòng)物無創(chuàng)測(cè)壓儀測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈壓，每只大鼠測(cè)量3 次，取其平均值作為該大鼠該次的尾動(dòng)脈壓。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始測(cè)壓，作為基礎(chǔ)壓，隨后每2 周測(cè)量1 次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定大鼠頸總動(dòng)脈壓。根據(jù)實(shí)驗(yàn)終末尾動(dòng)脈壓與基礎(chǔ)壓的比較及頸動(dòng)脈壓水平，將M 組分為模型高血壓組(MH 組)12 只和模型血壓正常組(MN 組)12 只，共飼養(yǎng)24 周。高血壓大鼠判定標(biāo)準(zhǔn):處理后血壓增加20 ～30 mmHg 并＞120 mmHg［15］。

2.3 HE 染色 組織經(jīng)固定24 h 后，進(jìn)行脫水、透明及石蠟包埋。脫蠟至水→蘇木素染液3 ～4 min→自來水(流水)沖洗30 s→1%鹽酸乙醇分化返蘭2 ～3 s→自來水(流水)沖洗5 ～10 min→伊紅染液2 min→自來水(流水)沖洗30 s →95%乙醇數(shù)秒→95%乙醇數(shù)秒→無水乙醇數(shù)秒→烤箱烤干，60 ℃3 ～5 min→中性樹膠封片。統(tǒng)一在400 倍的顯微鏡下觀察并拍片，每個(gè)標(biāo)本選取5 個(gè)橫切面，用Image Pro－ Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)測(cè)量主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈中膜厚度(media thickness，MT)(按順時(shí)針方向測(cè)5 個(gè)值取均值)。

2.4 Masson 染色 取主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈一級(jí)分支固定24 h 后，進(jìn)行脫水、透明及石蠟包埋。Masson染色步驟:石蠟切片脫蠟至水→蘇木素染液7 min→流水沖洗→1%鹽酸酒精分化→流水沖洗→麗春紅酸性復(fù)紅染色5 min→0.5%冰乙酸沖洗→1%磷鉬酸數(shù)秒→0.5%冰乙酸沖洗→2%亮綠染色1 min →烤箱烤干(60 ℃3 ～5 min)→中性樹膠封片。Masson染色使膠原纖維呈綠色，肌纖維和彈力纖維呈紅色。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5 個(gè)視野，拍照記錄。用Image－Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析，測(cè)量血管膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF 為膠原面積與記錄區(qū)域總面積的比值，每個(gè)標(biāo)本取5 個(gè)視野的均值作為其結(jié)果。

2.5 主動(dòng)脈Smad2、Smad3 和Smad7 實(shí)時(shí)熒光定量

PCR 用Trizol 試劑提取大鼠主動(dòng)脈中膜總RNA，隨后按Qiagen RNeasy Mini Kit 說明書對(duì)RNA 進(jìn)行純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣本在260 和280 nm 的吸光度值(A260和A280)，所得A260/A280在1.80 ～2.20之間認(rèn)為純度符合要求。配置40 μL 50 mg/L RNA逆轉(zhuǎn)錄液，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。結(jié)果以目的基因/β－actin 的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 免疫組化染色檢測(cè)主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈PCNA、p－ERK1/2、TGF－β1、p－Smad2/3和Smad7 表達(dá) 主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫封閉10 min，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，檢測(cè)TGF－β1和Smad7 的切片置入裝有檸檬酸鹽緩沖液(pH9.0)的微波盒中，微波中火修復(fù)12 min，取出微波盒自然冷卻至室溫;檢測(cè)PCNA、p－ERK1/2 和p－Smad2/3 的切片放入裝有檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的高壓鍋中，修復(fù)90 s，關(guān)閉電源，冷卻15 min后放氣，打開鍋蓋，自然冷卻至室溫，取出玻片置于濕盒中，PBS 沖洗3 次，每次3 min，將組織周圍的水擦干，滴加Ⅰ抗將整個(gè)組織覆蓋(Ⅰ抗的濃度:PCNA 1∶100，p－ERK1/2 1∶50，TGF－β11∶100，p－Smad 2/3 1∶50，Smad7 1∶50)，4 ℃冰箱過夜，將濕盒從冰箱取出，室溫下復(fù)溫20 min，PBS 沖洗，滴加Ⅱ抗聚合物，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗，滴加Ⅱ抗37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗，DAB 顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，流水沖洗10 min，蘇木素復(fù)染3 ～5 min，流水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用Leica DM2500 光學(xué)顯微鏡照相記錄圖片，每張切片在固定的曝光時(shí)間、固定的光圈數(shù)和固定的顯微鏡亮度情況下，400 倍鏡下進(jìn)行圖片的采集。利用Image－Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，校正好光密度，隨機(jī)對(duì)每個(gè)標(biāo)本的5 幅圖片進(jìn)行分析平均吸光度(胞漿表達(dá))或陽性細(xì)胞表達(dá)率(胞核表達(dá))，每組分析6 個(gè)標(biāo)本。平均吸光度計(jì)算方法:即主動(dòng)脈或腸系膜動(dòng)脈中膜中陽性染色的積分吸光度(IA)與其動(dòng)脈中膜面積的比值;陽性細(xì)胞表達(dá)率計(jì)算方法:即主動(dòng)脈或腸系膜動(dòng)脈中膜中陽性染色細(xì)胞核的數(shù)量與其動(dòng)脈中膜總細(xì)胞核數(shù)量的比值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較采用t 檢驗(yàn);多組間比較采用方差分析，方差齊使用LSD 法，方差不齊使用Tamhane’s T2 法，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠血壓和主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈中膜厚度變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與C 組、MN 組和T 組相比，MH 組尾動(dòng)脈收縮壓和頸動(dòng)脈平均壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，其余各組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TMH 組和MN 組主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈MT 與C組相比顯著增高(P ＜0.05)，T 組MT 降低(P ＜0.05)，MH 組和MN 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 各組大鼠血壓及主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈中膜厚度比較Table 1. The comparison of blood pressure and media thickness(MT)of aorta and mesenteric artery in various groups(±s)

表1 各組大鼠血壓及主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈中膜厚度比較Table 1. The comparison of blood pressure and media thickness(MT)of aorta and mesenteric artery in various groups(±s)

C:control group;MH:high－salt model with hypertension group;MN:high－salt model without hypertension group;T:high－salt + telmisartan group. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs C;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs T;△P ＜0.05 vs MN.

Group n Systolic blood pressure(mmHg)Carotid blood pressure(mmHg)Aorta MT(μm)Mesenteric artery MT(μm)12±7.20 MH 12 161.21±21.65* #△ 145.82±5.84* #△ 115.29±16.25＊＊## 71.87±15.93* #MN 12 123.25±11.20 125.04±6.16 103.22±7.98* # 63.75±2.23* #T 13 126.37±7.23 121.60±11.07 80.95±10.89 50 C 13 123.97±6.39 118.12±8.33 84.91±11.61 52..75±6.12

2 各組大鼠主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈HE 染色和Masson 染色

與對(duì)照組相比，MH 組和MN 組主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈中膜細(xì)胞層數(shù)增加，細(xì)胞核數(shù)量增加，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，彈性膜彎曲、紊亂，T 組這些現(xiàn)象均明顯減輕，見圖1。

主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈中膜血管平滑肌細(xì)胞胞漿呈紅色，膠原纖維呈綠色，細(xì)胞核呈棕紫色。與C 組比較，MH 組和MN 組中膜膠原容積分?jǐn)?shù)顯著增高(P ＜0.01);T 組主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈中膜膠原容積分?jǐn)?shù)顯著低于MH 和MN 組(P ＜0.01);MH 組與MN 組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖2。

Figure 1. HE staining of aorta (A)and mesenteric artery (B)in various groups (×400).圖1 各組大鼠主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈的HE 染色

Figure 2. Masson staining of aorta (A)and mesenteric artery(B)in various groups (×400). ± s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs C;##P ＜0.01 vs T.圖2 各組大鼠主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈Masson 染色

3 各組大鼠主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈PCNA 蛋白表達(dá)

免疫組化圖片顯示血管中膜平滑肌細(xì)胞中PCNA 蛋白被染成棕黃色，在胞核內(nèi)表達(dá)。與C 組比較，MH 組和MN 組主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈中膜PCNA表達(dá)增高(P ＜0.05)，表明主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈中膜血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖;經(jīng)替米沙坦干預(yù)后，PCNA 表達(dá)下降;與MN 組相比，MH 組表達(dá)無顯著差異，見圖3。

4 各組大鼠主動(dòng)脈TGF－β1、Smad2、Smad3 及Smad7 mRNA 的表達(dá)情況

通過real－time PCR 檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈中膜TGF－β1、Smad2、Smad3 及Smad7 mRNA 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與C 組比較，MH 組和MN 組主動(dòng)脈的TGF－β1和Smad2 mRNA 表達(dá)增高(P ＜0.05)，MN 組Smad3表達(dá)降低(P ＜0.05)，MH 組Smad7 表達(dá)升高(P ＜0.05);經(jīng)替米沙坦干預(yù)后，TGF－β1、Smad2 及Smad7 mRNA 表達(dá)下降(P ＜0.05);與MN 組相比，MH 組Smad3 和Smad7 mRNA 表達(dá)較高(P ＜0.05)，而TGF－β1和Smad2 表達(dá)無顯著差異，見圖4。

Figure 3. Immunohistochemical staining showed the expression of PCNA in aorta (A)and mesenteric artery (B). ±s.n =6. * P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs C;#P ＜0.05 vs T.圖3 免疫組化染色顯示主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈中PCNA 的表達(dá)

Figure 4. The expression of TGF－β1，Smad2，Smad3 and Smad7 mRNA in aorta from various groups. ±s.n =8. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs C;#P ＜0.05 vs T;△P＜0.05 vs MN.圖4 各組大鼠主動(dòng)脈中TGF－β1、Smad2、Smad3 和Smad7 mRNA 的表達(dá)

5 各組大鼠主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7 和p－ERK1/2 蛋白表達(dá)情況

免疫組化圖像可見血管中膜平滑肌細(xì)胞中TGF－β1蛋白呈棕黃色表達(dá)在胞漿內(nèi)，p－Smad2/3 蛋白呈棕黃色在胞核內(nèi)表達(dá)，Smad7 蛋白在胞核及核周圍均有棕黃色表達(dá)。與C 組比較，MH 組和MN 組主動(dòng)脈中膜的TGF－β1、p－Smad2/3 和p－ERK1/2 表達(dá)增高(P ＜0.05)，而Smad7 表達(dá)減少(P ＜0.05);經(jīng)替米沙坦干預(yù)后，TGF－β1、p－Smad2/3 和p－ERK1/2 表達(dá)下降，Smad7 表達(dá)上升(P ＜0.05);與MN 組相比，MH 組TGF－β1表達(dá)較高(P ＜0.05)，Smad7 表達(dá)較低(P ＜0.05)，而p－Smad2/3 和p－ERK1/2 表達(dá)無顯著差異，見圖5、表2。

Figure 5. Immunohistochemical staining showed the expression of TGF－β1，p－Smad2/3，Smad7 and p－ERK1/2 in aorta (×400)圖5 免疫組化染色顯示主動(dòng)脈中TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7 和p－ERK1/2 的表達(dá)

表2 各組大鼠主動(dòng)脈中膜TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7和p－ERK1/2 陽性表達(dá)百分比Table 2. The percentages of the positive expression of TGF－β1，p－Smad2/3，Smad7 and p－ERK1/2 in rat aorta from various group (±s.n=6)

表2 各組大鼠主動(dòng)脈中膜TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7和p－ERK1/2 陽性表達(dá)百分比Table 2. The percentages of the positive expression of TGF－β1，p－Smad2/3，Smad7 and p－ERK1/2 in rat aorta from various group (±s.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs C;##P ＜0.01 vs T;△P ＜0.05 vs MN.

Group TGF－β1 p－Smad2/3 Smad7 p－ERK1/2 C 7.22±1.31 9.52±3.11 33.80±6.28 7.18±2.82 MH 14.20±3.21＊＊##△24.60±7.51＊＊## 6.21±1.52＊＊##△29.30±5.77＊＊##MN 9.98±1.76＊＊## 21.40±6.92＊＊## 20.10±3.64＊＊ 25.10±5.06＊＊T 8.35±1.83 14.40±4.59 25.70±3.44 13.50±4.73

與C 組比較，MH 組、MN 組腸系膜動(dòng)脈中膜的TGF－β1、p－Smad2/3 和p－ERK1/2 表達(dá)增高(P ＜0.01)，Smad7 表達(dá)下降(P ＜0.01);經(jīng)替米沙坦干預(yù)后，TGF－β1、p－Smad2/3 和p－ERK1/2 表達(dá)下降，Smad7 表達(dá)升高(P ＜0.01);與MN 組相比，MH 組TGF－β1表達(dá)較高(P ＜0.05)，p－Smad2/3 有升高趨勢(shì)(P ＞0.05)，但無顯著差異，而Smad7 和p－ERK1/2 表達(dá)無顯著差異(P ＞0.05)，見圖6，表3。

討 論

Figure 6. Immunohistochemical staining showed the expression of TGF－ β1，p－Smad2/3，Smad7 and p－ERK1/2 in mesenteric artery (×400).圖6 免疫組化染色顯示腸系膜動(dòng)脈中TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7 和p－ERK1/2 的表達(dá)

表3 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈中膜TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7 和p－ERK1/2 陽性表達(dá)百分比Table 3. The percentages of the positive expression of TGF－β1，p－Smad2/3，Smad7 and p－ERK1/2 in rat mesenteric artery from various groups (±s.n=6)

表3 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈中膜TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7 和p－ERK1/2 陽性表達(dá)百分比Table 3. The percentages of the positive expression of TGF－β1，p－Smad2/3，Smad7 and p－ERK1/2 in rat mesenteric artery from various groups (±s.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs C;##P ＜0.01 vs T;△P ＜0.05 vs MN.

Group TGF－β1 p－Smad2/3 Smad7 p－ERK1/2 C 4.34±0.90 6.21±0.85 23.30±3.51 8.34±3.59 MH 10.40±2.01＊＊##△29.80±6.21＊＊## 14.60±3.25＊＊## 21.60±3.84＊＊##MN 8.95±1.98＊＊## 25.40±4.97＊＊## 14.20±3.13＊＊## 18.10±3.99＊＊##T 5.72±1.83 16.10±3.32 20.50±4.04 12.50±3.76

在高血壓等病理狀態(tài)下，VSMCs 功能發(fā)生改變，細(xì)胞由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，細(xì)胞合成與分泌功能增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)含量增加，成分改變，尤其是膠原堆積，是導(dǎo)致血管重構(gòu)的重要原因之一。慢性鹽負(fù)荷可通過血壓或獨(dú)立于血壓影響血管及心臟的結(jié)構(gòu)和功能，增加心血管疾病的發(fā)生率和死亡率。7%NaCl 高鹽飼養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)4 個(gè)月，其血壓升高幅度較正常鹽飼養(yǎng)的SHR 明顯增大，血管明顯增厚，彈性纖維和膠原纖維增多［16］;用高鹽喂養(yǎng)(8% NaCl)鹽敏感性高血壓大鼠后，其主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈管壁也明顯增厚［17］;Simon 等［10］研 究發(fā) 現(xiàn)高鹽(2%NaCl)飲食雖不能引起SD 大鼠血壓升高，但卻可以引起血管明顯的重構(gòu)現(xiàn)象，故推測(cè)高鹽飼養(yǎng)可直接致血管重構(gòu)，而血壓升高并非主要因素。目前國(guó)內(nèi)外研究主要針對(duì)于鹽敏感性高血壓大鼠、SHR 及部分腎切除鹽敏感性大鼠，而本實(shí)驗(yàn)以無遺傳易感性或解剖生理學(xué)缺損的正常Wistar 大鼠為研究對(duì)象，給予長(zhǎng)期(6 個(gè)月)高鹽(8% NaCl)飼養(yǎng)后，無論大鼠是否形成高血壓，均發(fā)生主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈中膜厚度增加，VSMCs 增殖，層數(shù)增多，排列紊亂，膠原纖維沉積，說明長(zhǎng)期高鹽飲食可以獨(dú)立于血壓導(dǎo)致正常Wistar 大鼠血管重構(gòu)。

Smads 蛋白家族是TGF－β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中參與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或調(diào)節(jié)的重要分子。TGF－β 與受體結(jié)合后，使其下游信號(hào)通道蛋白Smad2 分子和Smad3 分子磷酸化，進(jìn)而與Smad4 蛋白形成復(fù)合物，活化的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與其它同時(shí)合成的核轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Smad2/3 是TGF－ β1致纖維化作用的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，而Smad7 是TGF－β1/Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要抑制性調(diào)控蛋白，可抑制TGF－ β1激活的Smad2/3 磷酸化和核轉(zhuǎn)位，從而對(duì)TGF－ β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起負(fù)反饋抑制作用，降低TGF－β1信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間［14］。Smad7 過度表達(dá)還能明顯減少血管外膜膠原含量，延緩球囊成形術(shù)后血管纖維化過程［18］，提示Smad7 可以延緩血管纖維化過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高鹽模型組主動(dòng)脈TGF－β1、Smad2、Smad3 及Smad7 mRNA 水平均較對(duì)照組升高，這與有關(guān)文獻(xiàn)［19］報(bào)道在肝纖維化初期，TGF－β1可促進(jìn)Smad7 mRNA 升高，但抑制作用仍不足以拮抗由Smad2 和Smad3 mRNA 升高所產(chǎn)生的肝纖維化進(jìn)展的結(jié)論相符合;與正常鹽對(duì)照組相比，高鹽模型組TGF－β1及下游分子p－Smad2/3 蛋白表達(dá)上升，Smad7 蛋白表達(dá)減少，提示高鹽飲食可以促進(jìn)血管中膜TGF－β1和p－Smad2/3 表達(dá)，抑制Smad7 表達(dá)，TGF－β1/Smad 信號(hào)通路可能參與調(diào)控高鹽所致大鼠血管重構(gòu)過程。此外，有研究發(fā)現(xiàn)血漿TGF－β1水平升高與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)［20］，我們的研究觀察到，模型高血壓組主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈TGF－β1表達(dá)高于模型正常血壓組，提示TGF－β1在高鹽誘導(dǎo)血壓升高過程中發(fā)揮一定作用;模型高血壓組主動(dòng)脈Smad7 表達(dá)低于模型正常血壓組，模型高血壓組腸系膜動(dòng)脈p－Smad2/3 蛋白表達(dá)較模型正常血壓組有升高趨勢(shì)。TGF－β1效應(yīng)的發(fā)揮主要與TGF－β1和受體調(diào)節(jié)性Smad2/3 或抑制性Smad7 結(jié)合有關(guān)［21］，在主動(dòng)脈Smad7 表達(dá)減少，對(duì)TGF－β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起負(fù)反饋?zhàn)饔?，增高TGF－β1信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，而在腸系膜動(dòng)脈TGF－β1通過Smad2/3 使得信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑激活，提示TGF－β1在主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈分別通過調(diào)節(jié)Smad7 和Smad2/3 表達(dá)共同參與高鹽致高血壓的發(fā)生發(fā)展。

TGF－β1激活的信號(hào)通路主要有以下幾種，Smads 通路、MAPK 通路、NF－κB 通路、磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3－kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路等。MAPK 超家族包括3 個(gè)亞家族:p38 MAPK、ERK 和c－Jun 氨基末端激酶。MAPK/ ERK 的阻斷劑可通過影響AngⅡ介導(dǎo)的Ⅰ型膠原合成從而緩解血管纖維化［12］。p38 MAPK 阻斷劑可以抑制TGF－β1誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，但并未影響Smads 的表達(dá)與功能，提示該阻斷劑抑制TGF－β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖不依賴Smads而通過MAPK 發(fā)揮作用［22］。MAPK 超家族激活可以促進(jìn)膠原合成和VSMCs 增殖，但其中ERK 在高鹽引起血管重構(gòu)中的作用知之甚少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在高鹽飲食下，ERK1/2 蛋白磷酸化水平顯著升高，說明ERK 通路也參與了高鹽飲食誘導(dǎo)血管重構(gòu)過程。MAPK 與TGF－β1/Smads 通路之間存在交互通話，Rodriguez－Vita 等［13］及Wang 等［11］分別應(yīng)用p38 MAPK 或ERK1/2 抑制劑阻斷AngⅡ介導(dǎo)的Smads活化及下游促血管重構(gòu)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，證實(shí)MAPK 超家族通過與TGF－β1/Smads 通路的交互通話而影響Smads 活性最終參與血管重構(gòu)過程。我們的結(jié)果顯示高鹽可使p－ERK1/2、p－Smad2/3 和Smad7 表達(dá)均發(fā)生改變，提示ERK 通路與Smads 通路共同參與了高鹽飲食致血管重構(gòu)的發(fā)生，但ERK1/2 與TGF－β1/Smads 交互對(duì)話機(jī)制，有待利用ERK 阻斷劑進(jìn)一步研究。

血管重構(gòu)是高血壓等心血管疾病共同的病理生理特征之一，與RAS 活性表達(dá)異常密切相關(guān)，AngⅡ可通過其AT1 受體介導(dǎo)慢性心血管疾病中心肌及血管膠原增生，導(dǎo)致膠原比例失調(diào)與心血管重塑。高鹽可以使鹽敏感大鼠組織局部RAS 激活，動(dòng)脈組織AT1受體mRNA 和密度增加，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)mRNA 和蛋白表達(dá)增加，動(dòng)脈壁增厚和膠原沉積，AT1受體阻斷劑和ACE 抑制劑能阻止高鹽飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈膠原沉積和結(jié)構(gòu)重塑［9，23－25］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出替米沙坦能在一定程度內(nèi)下調(diào)TGF－β1、p－Smad2/3 和p－ERK1/2 表達(dá)，上調(diào)Smad7 表達(dá)，有效抑制高鹽所致大鼠主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈重構(gòu)過程，表明替米沙坦可部分通過阻斷AT1受體影響TGF－β1/Smads 和ERK 通路發(fā)揮抗血管重構(gòu)作用。

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