杜 玲，孫 俊，劉建生，程計(jì)林△

(1上海市公共衛(wèi)生臨床中心消化科，2上海瑞金醫(yī)院集團(tuán)閔行區(qū)中心醫(yī)院消化科，上海 201508)

金屬蛋白酶組織抑制物－1(tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1)由激活的肝星狀細(xì)胞、肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌表達(dá)，其主要作用是抑制膠原酶的活性，同時(shí)抑制基質(zhì)分解素和明膠B[1－2]。TIMP－1可以抑制大部分基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)，尤其是MMP－1的活性，使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解減少，促進(jìn)肝纖維化的形成，被認(rèn)為在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用[1－3]。大量研究顯示，肝組織內(nèi)TIMP－1水平與肝組織炎癥和肝纖維化程度呈密切相關(guān)關(guān)系。已有研究表明抑制TIMP－1活性能緩解甚至抑制肝纖維化進(jìn)程，因而TIMP－1成為抗肝纖維化免疫治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[1－5]。

TIMP－1蛋白約28.5 kD，其編碼基因位于X染色體p11區(qū)，含有1個(gè)開放讀碼區(qū)，編碼208個(gè)氨基酸，蛋白的N端為主要活性區(qū)域[1－2，5－7]。基于 TIMP － 1 的一級(jí)結(jié)構(gòu)，利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測TIMP－1 B細(xì)胞表位，采用8分支多重抗原肽(multiple antigen pepetide，MAP)系統(tǒng)設(shè)計(jì)合成多抗原肽[8－9];以白細(xì)胞介素1β(interleukin－1 beta，IL －1β)163 －171肽作為通用型輔助表位肽(T－h(huán)elper epitope，TH)，能增強(qiáng)其它抗原肽的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)[10－12]。將二者聯(lián)合起來免疫動(dòng)物，誘導(dǎo)產(chǎn)生多克隆抗體，應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附測定、免疫印跡及免疫組化鑒定多克隆抗體滴度、特異性及其抗原在組織細(xì)胞中的表達(dá)，從而獲得潛在的B細(xì)胞表位肽，為以TIMP－1為靶標(biāo)的抗纖維化免疫治療研究提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

商品化TIMP－1重組蛋白(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為10934－HNAH);商品化抗體為多克隆兔抗人TIMP－1蛋白抗體(Epitomics，貨號(hào)為S0636)和單克隆鼠抗人TIMP－1全長蛋白抗體(Abcam，貨號(hào)為ab1827);弗氏完全佐劑及不完全佐劑(Sigma－Aldrich，F(xiàn)5881，F(xiàn)5506);酶標(biāo)羊抗兔IgG－HRPⅡ抗(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為BA1054);Western blotting化學(xué)發(fā)光試劑盒(上?？党缮锕こ坦?，批號(hào) KC－420);蛋白質(zhì) marker(Bio－Rad，批號(hào)為161－0376)。A431肺癌細(xì)胞購于上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院肝癌研究所。白毛黑眼兔(日本大白兔的1個(gè)支系)由上海市公共衛(wèi)生臨床中心動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 B細(xì)胞表位預(yù)測 利用DNAStar軟件和BcePred在線預(yù)測工具分析人TIMP－1的208個(gè)氨基酸序列，得到其編碼蛋白的物理和化學(xué)特性如親水性、可及性及可塑性等，并由此評(píng)估TIMP－1分子高親水性區(qū)域的抗原性。綜合2種分析方法，取其預(yù)測結(jié)果的重疊區(qū)域，作為TIMP－1蛋白的候選B細(xì)胞優(yōu)勢表位。

2.2 B細(xì)胞表位MAP抗原肽的合成 委托吉爾生化(上海)有限公司完成。以所選氨基酸肽段為基礎(chǔ)，采用8分支肽設(shè)計(jì)，固相合成法在多肽合成儀上合成，多肽經(jīng)高壓液相層析純化，純度達(dá)到97%以上。

2.3 MAP抗原肽與TIMP－1全蛋白抗體的結(jié)合力 分別用濃度為10 mg/L的不同MAP抗原肽或TIMP－1重組蛋白，按100 μL/well包被96孔酶聯(lián)板，4 ℃過夜，封閉后，加入1∶4000稀釋的商品化抗體，100 μL/well，以1:4000正常兔血清作對(duì)照。結(jié)果以雙復(fù)孔A均值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 動(dòng)物分組 雄性6月齡白毛黑眼兔18只，每只體重約2.5 kg，隨機(jī)分為6 組(MAP1 ～4、TIMP －1及正常組)，每組3只。

2.5 免疫方法 MAP1～4組分別以8分支肽MAP為免疫原，共注射4次，每次間隔2周。首次免疫用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑。首次及加強(qiáng)免疫量為每只MAP 1 mg，TIMP組每只200 μg，同時(shí)混入等量的 TH線性短肽，溶于0.5 mL PBS中，與0.5 mL弗氏佐劑乳化后，在背部皮內(nèi)作多點(diǎn)注射。正常組每只采用0.5 mL PBS與等量弗氏佐劑完全乳化后注射。

2.6 標(biāo)本采集與抗體檢測 首次免疫前及每次免疫10 d后采血，共采血5次。前4次耳中央動(dòng)脈采血，最后1次采取頸總動(dòng)脈放血，收集血液并分離血清。采用標(biāo)準(zhǔn)間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別用濃度為10 mg/L的MAP、TIMP－1重組蛋白及TH肽，按100 μL/well包被96孔酶聯(lián)板，4℃過夜，封閉后，Ⅰ抗為倍比稀釋的待測動(dòng)物免疫血清，免疫前血清作陰性對(duì)照，結(jié)果以雙復(fù)孔A均值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以待測標(biāo)本A值/陰性對(duì)照A值＞2.1為陽性標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為該樣本中抗體滴度。

2.7 蛋白電泳及蛋白印跡分析 將傳代培養(yǎng)的A431肺癌癌細(xì)胞(3×107)裂解后提取細(xì)胞蛋白，蛋白質(zhì)的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)參考 Laemmli等[13]的方法。Ⅰ抗分別為自制的MAP或TIMP－1兔血清抗體或商品化TIMP－1抗體，稀釋度為1∶3000，(商品化抗體稀釋度為1∶200)，以免疫前兔血清作陰性對(duì)照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 B細(xì)胞表位預(yù)測與多肽合成

BcePred分析預(yù)測TIMP－1可能的B細(xì)胞表位排名如下(95～109:YFHRSHNRSEEFLIA;133～147:LAQRRGFTKTYTVGC;57～71:LYQRYEIKMTKMYKG;27～41:VPPHPQTAFCNSDLV;193 ～207:EPGLCTWQSLRSQIAL)，而DNAStar軟件預(yù)測TIMP－1 B細(xì)胞表位排名為(95～109位，133～147位，57～71位，27～41位，173～187:QLLQGSEKGFQSRH，193～207位肽段)。2種方法所得結(jié)果基本一致。綜合2種分析方法，可以認(rèn)為4個(gè)肽段具有良好的親水性、可及性及可塑性，在二級(jí)結(jié)構(gòu)上位于蛋白伸展結(jié)構(gòu)或無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)內(nèi)，最可能為其優(yōu)勢B細(xì)胞表位。因此，我們以TIMP－1氨基酸序列為基礎(chǔ)分別合成4個(gè)8分支肽MAP，見表1。

表1 BcePred和DNAStar聯(lián)合預(yù)測的TIMP－1 B細(xì)胞抗原表位Table1.The B－cell epitopes predicted by BcePred and DNAS-tar softwares

2 合成MAP與TIMP－1全蛋白抗體的結(jié)合力

利用間接ELISA檢測所合成的MAP多肽與TIMP－1全長蛋白免疫抗體的結(jié)合力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAP4多肽與TIMP－1全蛋白抗體的結(jié)合力明顯強(qiáng)于 MAP1、MAP2和 MAP3，見圖1。

Figure1.Binding affinity of different MAPs with the commercialized rabbit anti－TIMP－1 antibody and control rabbit serum..n=3＊＊P＜0.01 vs negative serum;△△P＜0.01 vs TIMP －1.圖1 不同MAP與商品化TIMP－1抗體(單克隆鼠抗人TIMP－1全長蛋白抗體ab1827)的結(jié)合力

3 兔抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化

首次免疫10 d后即可檢出特異性抗體，MAP2、MAP3和MAP4免疫后3只兔子的平均最高抗體滴度為1∶80000、1∶8000和1∶120000。MAP2免疫的抗體滴度在第3次免疫后達(dá)高峰，MAP4免疫的抗體滴度在第3次免疫后達(dá)到平臺(tái)期，MAP3免疫的抗體滴度在第2次免疫后達(dá)到平臺(tái)期，對(duì)照組無抗體產(chǎn)生，TH肽與3種抗血清均無反應(yīng)，且4種MAP免疫血清與4種MAP之間均無交叉反應(yīng)，見圖2。

Figure2.Dynamic changes of anti－MAP antibody titers in rabbit serum..n=3＊＊P＜0.01 vs MAP1;△△P＜0.01 vs MAP2.圖2 不同MAP免疫后兔血清特異性抗體滴度動(dòng)態(tài)變化

4 蛋白電泳及蛋白印跡分析

以提取的A431細(xì)胞總蛋白為樣品，分別用MAP1－4抗血清與之反應(yīng)，用商品化兔抗人TIMP－1抗體作陽性對(duì)照，用相應(yīng)兔免疫前血清作陰性對(duì)照。商品化抗體在分子量約28.5 kD處出現(xiàn)1條清晰條帶，MAP1～4及重組TIMP－1抗血清均在分子量28.5 kD處出現(xiàn)清晰條帶。依據(jù)商品化抗體說明書，28.5 kD處為TIMP－1蛋白。陰性對(duì)照在無明顯條帶出現(xiàn)，見圖3。

Figure3.Specificity of the rabbit antisera against MAPs detected by Western blotting.M:protein marker;N:negative control，THpeptide antiserum;1～4:MAP1～4 antisera;TIMP:TIMP －1 antiserum;P:positive control，TIMP－1 rabbit antibody S0636.圖3 蛋白免疫印跡分析4種MAP兔抗血清抗體的特異性

討 論

肝纖維化是各種慢性肝病所引起的慢性肝損傷，對(duì)于中國為數(shù)眾多的肝炎患者，干預(yù)肝纖維化的形成與發(fā)展對(duì)防治肝硬化具有重要意義[15]。目前一般選用藥物對(duì)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的不同環(huán)節(jié)入手進(jìn)行干預(yù)，但療效欠佳，且需長期服藥。不僅增加了患者和社會(huì)的成本，而且嚴(yán)重降低了生活質(zhì)量。因此，發(fā)展包括免疫治療在內(nèi)的新型肝纖維化治療方法勢在必行，本研究擬篩選和鑒定TIMP－1的多抗原肽疫苗，試圖通過多抗原肽免疫抑制TIMP－1功能甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程，從而為肝纖維化的治療提供新的思路。

針對(duì)肝纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中的主要環(huán)節(jié)，ECM的降解異常是肝纖維化的一個(gè)重要因素。ECM的降解主要由一組依賴鋅的中性蛋白酶——MMP介導(dǎo)。TIMP是MMP的特異性抑制劑，在ECM的代謝調(diào)節(jié)中，是與MMP對(duì)應(yīng)的副調(diào)節(jié)劑。最近，在大鼠肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型上的研究發(fā)現(xiàn)，纖維化的逆轉(zhuǎn)伴隨TIMP－1和TIMP－2表達(dá)的迅速下降，MMP的mRNA表達(dá)無變化，而其活性顯著增加，表明TIMP降低可提高M(jìn)MP活性，使ECM降解重建[1－3]。而且，國內(nèi)最近也有文獻(xiàn)報(bào)道直接將MMP表達(dá)載體導(dǎo)入纖維化大鼠肝內(nèi)，其逆轉(zhuǎn)纖維化的作用有限，這從側(cè)面提示MMP活性的抑制物TIMP可能在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中的作用更為重要[3]。

誘導(dǎo)針對(duì)特異性腫瘤抗原或標(biāo)志物的體內(nèi)免疫反應(yīng)是當(dāng)前重要的免疫治療策略，但腫瘤抗原一般具有很低的免疫原性，難以獲得理想的免疫反應(yīng)強(qiáng)度;因此篩選獲得重要的B細(xì)胞表位并輔以T細(xì)胞抗原肽共同免疫是理想的解決方案。另外，免疫反應(yīng)性弱，難以誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)等也是多肽應(yīng)用的瓶頸所在。因此本研究基于前期對(duì)肝素酶表位肽疫苗免疫策略的探討，建立了誘導(dǎo)高滴度體液免疫反應(yīng)的方法[14]，并將以此實(shí)現(xiàn)對(duì)TIMP－1的抑制作用:利用TIMP－1 B細(xì)胞免疫優(yōu)勢表位，通過優(yōu)化的免疫策略(MAP+T細(xì)胞表位肽)在體內(nèi)誘導(dǎo)高滴度抗體，從而抑TIMP－1活性。這里我們僅針對(duì)TIMP－1蛋白的B細(xì)胞表位，而不是針對(duì)T細(xì)胞表位研究，因?yàn)槲覀冎饕窍胪ㄟ^B細(xì)胞表位肽來激活保護(hù)性的體液免疫，而不是激活具有殺傷性的細(xì)胞免疫，畢竟表達(dá)TIMP－1的主要細(xì)胞——肝星狀細(xì)胞也是分泌MMP的主要細(xì)胞，我們沒必要對(duì)其進(jìn)行殺傷。

為驗(yàn)證預(yù)測的B細(xì)胞表位是否具有特異性免疫原性，我們?nèi)斯ず铣上鄳?yīng)的MAP，并與T輔助表位肽一起免疫兔子后，得到多克隆抗血清。ELISA結(jié)果顯示，MAP2、MAP3和MAP4均能在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生 TIMP－1特異性抗體，其中MAP2和MAP4能誘導(dǎo)高滴度抗體，且與全長商品化抗體顯示了較高的親和力。這一結(jié)果提示，MAP2和MAP4為抗原優(yōu)勢表位，以其作為免疫原將可能誘導(dǎo)針對(duì)TIMP－1的特異性體液免疫反應(yīng)。針對(duì)TIMP－1的免疫治療尚需更深入的研究去闡明這些抗原表位是否為TIMP的中和性表位，即它們誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能否在與TIMP－1結(jié)合后，抑制后者活性，而起到抑制肝纖維化進(jìn)程的作用。

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