高子立

西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715

1 前言

蜂蜜是蜜蜂將采集的植物花蜜或植物細(xì)胞滲出的蜜露或昆蟲(chóng)排泄的甘露,混以蜜蜂唾液腺的分泌物,經(jīng)充分釀制而儲(chǔ)藏在蜜巢的甜物質(zhì)。蜂蜜不僅是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的保健食品,而且還具有多種生物學(xué)活性,如抗氧化、解毒、抗菌、消炎、滋潤(rùn)、防腐、保護(hù)創(chuàng)面、促進(jìn)細(xì)胞再生等[1]。

傳統(tǒng)食品中的抗氧化物質(zhì)可以保護(hù)生物體免受自由基的攻擊，可以預(yù)防癌癥、心腦血管疾病以及糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。自由基生物學(xué)研究認(rèn)為，活性氧自由基是導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞損傷的最主要氧化劑，它可以和細(xì)胞膜的多不飽和脂肪酸、細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)以及核酸等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生衰老和死亡[2]。

蜂蜜用作食品的歷史非常悠久，但它的抗氧化功能知道最近才被發(fā)現(xiàn)。蜂蜜抗氧化性的強(qiáng)弱取決于蜜源、季節(jié)、環(huán)境因素，以及蜜蜂的釀蜜過(guò)程。蜂蜜中的抗氧化成分包括黃酮和酚酸、酶類(lèi)（葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化氫酶）、抗壞血酸、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、類(lèi)胡蘿卜素物質(zhì)、有機(jī)酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等。這些天然的抗氧化劑具有抗菌、消炎、抗過(guò)敏、抗血栓形成和血管擴(kuò)張等廣泛的生物學(xué)活性。

2 蜂蜜抗氧化能力的測(cè)定

2.1 羥自由基清除能力比較

羥基自由基的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?可損傷蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物大分子，尤其對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的作用最強(qiáng)。·OH可直接作用于細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)不飽和脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)并最終生成丙二醛(MDA)。酚類(lèi)物質(zhì)能清除·OH是由于酚類(lèi)化合物提供了酚羥基上的氫，而使·OH還原。此外，酚類(lèi)物質(zhì)還能通過(guò)對(duì)金屬離子的絡(luò)合，降低Fenton反應(yīng)的速率，從而間接實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。

張文靜等[3]在測(cè)定總酸、還原糖、過(guò)氧化氫、淀粉酶值的基礎(chǔ)上,采用羥自由基清除法測(cè)定并比較了4種蜂蜜的抗氧化活性。

實(shí)驗(yàn)原理如下[4]：Fenton試劑(過(guò)氧化氫和硫酸亞鐵)是以過(guò)氧化氫為氧化劑,以Fe2+為催化系的氧化法,其反應(yīng)機(jī)理如下:

所產(chǎn)生的羥自由基與結(jié)晶紫作用后使體系吸光度降低,利用吸光度值的變化間接測(cè)定所產(chǎn)生的羥自由基。在一系列10 mL帶蓋比色管中分別加入1.4 mL結(jié)晶紫溶液(2×10-5mol/L)、1.0mL Fe2+溶液(5×10-3mol/L)、0.4 mL H2O2(1%)溶液,1.0 mLTris-HCl溶液(pH5.5),用二次蒸餾水稀釋到10 mL并搖勻,放置5 min后,在波長(zhǎng)588 nm處測(cè)定吸光度。

結(jié)果表明:4種蜂蜜均具抗氧化作用,洋槐蜜、枸杞蜜、椴樹(shù)蜜、棗花蜜對(duì)羥自由基的清除率分別為:4.96%、5.83%、16.8%、23.2% 。說(shuō)明蜂蜜能夠清除體內(nèi)過(guò)多的自由基,降低過(guò)氧化脂質(zhì)的生成,是很好的抗氧化產(chǎn)品。

2．2 超氧陰離子自由基的清除試驗(yàn)

超氧陰離子自由基是基態(tài)氧接受一個(gè)電子形成的第一個(gè)氧自由基，超氧陰離子自由基本身不很活潑，但由于超氧陰離子在體內(nèi)壽命很長(zhǎng)，它可以接受一個(gè)H+形成質(zhì)子化的超氧陰離子自由基HOO·，HOO·不帶電荷，具有疏水性，可以穿透細(xì)胞膜，擴(kuò)散到離生成位置很近的距離，到達(dá)靶位置，具有更大的危害性。在生物體內(nèi)，由于氧代謝的存在，主要發(fā)生酶促氧化還原反應(yīng)生成超氧陰離子自由基，其中黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子是機(jī)體常見(jiàn)的產(chǎn)生超氧陰離子的途徑[5]。

曹煒[7]等參考Beauchamp的方法對(duì)五種蜂蜜的超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)行了測(cè)試。實(shí)驗(yàn)原理如下：

光照核黃素產(chǎn)生超氧陰離子(O－2·)，超氧陰離子還原NBT生成藍(lán)色化合物。反應(yīng)體系包括3×10－6mol/L核黃素、1 × 10－2mol/L蛋氨酸、1 × 10－4mol/L NBT 及不同濃度的樣品，總反應(yīng)體系為5mL。將上述試劑和樣品混合后，放入20W的熒光燈箱中，調(diào)節(jié)燈和反應(yīng)物的距離使光照均勻。2 5℃下光照25min，在560nm處測(cè)定吸光值。

光超氧陰離子自由基清除率通過(guò)下式計(jì)算：

式中A為空白管的吸光值，A1為樣品管的吸光值。

試驗(yàn)結(jié)果表明五種蜂蜜對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力大小為枇杷蜜＞荊條蜜＞黨參蜜＞枸杞蜜＞黃芪蜜。

2.3 脂質(zhì)過(guò)氧化體的抑制作用

生物體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化主要發(fā)生在細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜的主要成分是磷脂和蛋白質(zhì)，其中磷脂中含有多不飽和脂肪酸，最容易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，很多疾病和衰老與脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)，因此預(yù)防機(jī)體內(nèi)的質(zhì)脂過(guò)氧化，對(duì)人類(lèi)的健康有重要的作用。引起機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的因素有很多，其中二價(jià)鐵離子是生物體內(nèi)最主要的脂質(zhì)過(guò)氧化促進(jìn)劑[7]。

曹煒[8]等以二價(jià)鐵離子為脂質(zhì)過(guò)氧化促進(jìn)劑，以卵磷脂脂質(zhì)體為模型，研究了蜂蜜對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用。試驗(yàn)原理如下：

10mL試管中加入0.2mL脂質(zhì)體溶液，不同體積的樣品和50mmol/L FeSO4溶液50μL，再加磷酸鹽緩沖溶液至3mL。不加樣品的反應(yīng)物作為模型，不加FeSO4溶液作為空白，將反應(yīng)物置于37℃中水浴40min，每5min振搖一次。最后加入10%三氯乙酸1mL，0.8%硫代巴比妥酸1mL，混勻，置沸水中15min，立刻用冰水冷卻，在5000r/min下離心10min，取上清液在532nm處測(cè)定吸光度(A)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，各種蜂蜜的清除能力大小依次為：黨參蜜＞荊條蜜＞枇杷蜜＞黃芪蜜＞枸杞蜜。

2.4 還原能力測(cè)定

Yen[9]和 Siddhuraju,P[10]等人研究表明，抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在聯(lián)系?？寡趸瘎┦峭ㄟ^(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基的[11]，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。因此可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的大小。

徐坤[112]等在10mL試管中分別加入不同濃度樣品1mL，磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L，pH＝6.6)2.5mL和1%鐵氰化鉀5mL，置于50℃水浴中反應(yīng)20min，然后加入10% 的三氯乙酸5mL，搖勻。吸取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液。樣品在700nm處測(cè)定吸光值。反應(yīng)物的吸光值增加表明還原力增強(qiáng)。

試驗(yàn)結(jié)果表明5種蜂蜜還原力的大小順序依次為荊條蜜＞枇杷蜜＞黨參蜜＞枸杞蜜＞黃芪蜜。

2.5 蜂蜜中總酸酚含量的測(cè)定

徐坤等參考Folin－Ciocalteu[12]法測(cè)定。準(zhǔn)確移取1.0mL稀釋后的蜂蜜溶液，加入1mL的Folin－Ciocalteu試劑，混勻，然后加入5mL 1mol/L的碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至10mL，充分混勻，在黑暗條件下放置1h，用1cm的比色杯在波長(zhǎng)為760nm下測(cè)定光密度值。將對(duì)照品原兒茶酸配置成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，樣品中總酚酸的含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中查出相應(yīng)的值，蜂蜜總酚酸含量以原兒茶酸的相對(duì)量表示。

試驗(yàn)結(jié)果表明4種蜂蜜的酚酸含量大小順序依次是紫云英蜜＞棗花蜜＞枸杞蜜＞益母草蜜。

3 總結(jié)

蜂蜜的質(zhì)量取決于它們的化學(xué)成分和植物來(lái)源。而多酚化合物的含量受到植物來(lái)源、地理來(lái)源和氣候特征的影響，因而鑒定和量化蜂蜜中的多酚化合物意義重大。此外，多種蜂蜜均有抑制超氧陰離子自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用表明蜂蜜是一種很好的抗氧化保健食品。

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