(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院，北京 100020)

肝素(Heparin)是一種抗凝劑［1］，是由 D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重復(fù)二糖單位組成的多糖，在體內(nèi)外均有抗凝血作用。臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)、血液透析等。血栓彈力圖(TEG)是應(yīng)用高敏感懸垂絲描記血液凝固過程中凝塊大小并生成圖形的一種分析儀［2］，主要針對凝血狀態(tài)的研究，具有真實還原凝血全貌、敏感度高、檢測精準(zhǔn)、結(jié)果直觀和數(shù)據(jù)詳細(xì)等特點［3］。2010年10月～2011年10月，我們采用TEG對肝素作用下的凝血過程進(jìn)行整體監(jiān)測，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 健康志愿測試者60名，其中男34名，女性26名;全部受試者年齡、體質(zhì)量、身高均無統(tǒng)計學(xué)差異。排除標(biāo)準(zhǔn):①6個月內(nèi)出血，活動性消化性潰瘍;②血小板計數(shù)小于100×109/L;③嚴(yán)重肝、腎、肺和血液系統(tǒng)疾病;④6個月內(nèi)發(fā)生的腦血管事件、顱腦外傷、腫瘤、手術(shù)、動脈性顱內(nèi)病變(動脈瘤、腫瘤);⑤未控制的高血壓(收縮壓≥200 mm-Hg和/或舒張壓≥110 mmHg);⑥妊娠;⑦1周內(nèi)應(yīng)用過抗凝及抗血小板藥物;⑧風(fēng)濕活動的證據(jù);⑨家族血液病史。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑與儀器 枸櫞酸鈉抗凝管(2.7 mL，BD Corp，美國);TEG-5000(Haemoscope Corp，美國);Thrombelastograph Analyzer配套進(jìn)口試劑高齡土促進(jìn)劑Kaolin、氯化鈣(CaCl2)及原廠質(zhì)控Control level I(Thrombelastograph Analyzer TEG-5000，Haemoscope Corp，美國);肝素鈉注射液(12 500 U，2 mL，天津生物化學(xué)制藥廠，中國)。所有健康志愿者行肘前靜脈采血。分別用 0、1、2、3、4、5、6 U/mL 肝素加入待測血樣中。取枸櫞酸化凝血1 mL置高嶺土管內(nèi)，靜置5 min，取340 UL上樣，加氯化鈣20 UL。檢測中以配套進(jìn)口高嶺土促進(jìn)劑(Kaolin)作為激活劑，以配套進(jìn)口CaCl2作為復(fù)鈣劑。不再額外使用任何試劑激活。

1.2.2 相關(guān)參數(shù)測定 采用TEG繪制正常凝血及低凝血狀態(tài)曲線圖，同時測定下列參數(shù):①凝血因子水平(R值):指從標(biāo)本開始檢測至描記幅度2 mm所需的時間，即從血注入容器內(nèi)到開始發(fā)生凝固的時間，是引起初期纖維蛋白形成所必須的時間;主要反映凝血因子活性，參考范圍:5～10 min;② 纖維蛋白原時間(K):從描記幅度2 mm至描記幅度達(dá)20 mm所需時間。反應(yīng)纖維蛋白和血小板在血凝塊開始形成時的共同作用時間，即血凝塊形成的速率，參考范圍:1～3 min;③最大血塊強度(MA):即描記圖上的最大幅度，或最大切應(yīng)力系數(shù)，為圖形兩側(cè)最寬距離。相當(dāng)于血栓的最大堅固度。MA值與血小板聚集功能及纖維蛋白原的量有關(guān)，參考范圍:50～70 mm;④凝血綜合指數(shù)(CI):在TEG自動描記和檢測中自動報告的參數(shù)之一，是對標(biāo)本凝血狀態(tài)的綜合評估。＜－3為低凝，－3～+3為正常，＞+3為高凝;⑤最大血塊形成時間(TMA):測量形成穩(wěn)定血凝塊所需時間。即從凝血開始至MA值確定所需用的時間。TMA反應(yīng)血凝塊的全程形成速率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示。兩獨立樣本均數(shù)比較的t檢驗，曲線擬合采用MatLab 7.0數(shù)學(xué)軟件計算。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同濃度肝素作用下TEG各項參數(shù)值比較見表1;TEG正常及低凝血曲線見圖1、圖2。

3 討論

表1 不同濃度肝素作用下TEG各項參數(shù)值(±s)

表1 不同濃度肝素作用下TEG各項參數(shù)值(±s)

注:與0 U/mL比較，*P ＜0.05;與3 U/mL比較，△P ＜0.05

濃度級(U/mL)R值(min)K值(min)MA值(mm) CI值 TMA(min)0 7.2 ±0.6 2.1 ±0.6 63.4 ±2.4 1.2 ±0.8 29.8 ±2.7 1 8.8 ±1.4 2.3 ±0.7 62.7 ±1.7 0.8 ±1.1 31.3 ±1.8 2 8.9 ±0.7 2.4 ±0.4 61.1 ±2.6 -0.7 ±3.2 31.5 ±2.3 3 11.4 ±2.2* 2.8 ±0.6 52.3 ±3.2* －0.9 ±2.6 31.8 ±3.4 4 13.1 ±1.8* 4.2 ±1.1＊△ 44.6 ±1.8* －2.7 ±1.3* 43.4 ±1.5*5 17.9 ±3.1* 2.7 ±0.7 41.3 ±3.7* －3.3 ±2.3* 48.3 ±2.1*6 23.6 ±1.6＊△ 2.5 ±1.0 40.2 ±4.1* －5.2 ±3.1＊△51.1 ±1.4＊△

圖1 TEG正常凝血曲線

圖2 TEG低凝血曲線

肝素是一類多糖，由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4鍵連接起來的重復(fù)二糖單位組成的多糖鏈的混合物。含10～30個二糖單位，相對分子質(zhì)量4 000～20 000，平均 12 000。L-α-艾杜糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖是其中的主要單糖，由它們所組成的三硫酸二糖重復(fù)單位構(gòu)成了肝素結(jié)構(gòu)的主要部分。肝素是臨床應(yīng)用的一種主要抗凝藥物［4］。在抗凝血酶Ⅲ［5］(ATⅢ)的參與下，相對分子質(zhì)量大于5 000的肝素能抑制凝血酶(FⅡa)及活化十因子(FXa)的活性，而在同樣的條件下，小分子量的肝素則只能抑制FXa的活性。ATⅢ屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，是血凝過程中絲氨酸蛋白酶，尤其是FⅡa及FXa的主要抑制劑。ATⅢ通過暴露的活性中心環(huán)以底物的形式與凝血酶的活性中心結(jié)合，形成一個緊密的不可逆的復(fù)合物。徹底抑制凝血酶活性，從而延長凝血時間，抑制血栓生成。正常情況下ATⅢ與凝血酶反應(yīng)速度較慢，但當(dāng)肝素存在時，其結(jié)合速度將增加上千倍，并能有效提高抗凝效果。從而達(dá)到抗凝目的。本研究結(jié)果顯示，隨肝素濃度逐漸增加R值明顯延長，說明在足量肝素濃度的作用下，凝血因子生成凝血酶的過程得到抑制。驗證了肝素抗凝理論的準(zhǔn)確性。

隨著對肝素藥理作用認(rèn)識的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)，肝素在發(fā)揮其抗凝作用的同時，可能會造成血小板聚集功能的抑制［6］，其對血小板活化的影響日益受到人們的關(guān)注。血小板表面膜糖蛋白含量豐富，在血小板黏附、聚集和釋放反應(yīng)中起著重要作用。其中，糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體復(fù)合物是血小板膜上含量最多的糖蛋白，是所有激活劑活化血小板的最終途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，隨肝素濃度的增加MA值明顯減小，TMA值明顯延長。說明在足量肝素濃度的影響下，MA降低、TMA延長，血小板的聚集功能受到抑制。志愿者被測血液表現(xiàn)為明顯低凝狀態(tài)。也有臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗血小板藥物聯(lián)合肝素共同治療心血管患者，發(fā)生血栓的風(fēng)險明顯降低［7］。這可能是因為凝血因子生成的凝血酶是一種血小板聚集的強激活劑。肝素加強了ATⅢ與凝血酶的結(jié)合速率，可以有效抑制凝血酶生成。因此在整體凝血過程中，肝素大大降低了凝血酶對血小板聚集功能的激活作用，抑制血小板膜表面糖蛋白受體GPⅡb/Ⅲa的活性，使標(biāo)本血液表現(xiàn)為一種低凝狀態(tài)。

纖維蛋白原也是參與凝血的重要組成部分［8］。纖維蛋白原由α、β、γ三對不同多肽鏈所組成，多肽鏈間以二硫鍵相連。凝血啟動后，α鏈與β鏈分別釋放出A肽與B肽，生成纖維蛋白單體。在此過程中，由于釋放了酸性多肽，負(fù)電性降低，單體易于聚合成纖維蛋白多聚體。并在FⅣa與FⅩⅢa因子作用下，單體之間以共價鍵相連，則變成穩(wěn)定的不溶性纖維蛋白凝塊，完成凝血過程。本研究發(fā)現(xiàn)，肝素濃度對K值不具有線性關(guān)系。這說明雖然肝素和纖維蛋白原存在某種凝血關(guān)系，但是纖維蛋白原的變化不隨肝素濃度的增加而降低。這可能是因為TEG是通過血凝塊強度變化來評價患者凝血狀態(tài)，而在血塊形成過程中血塊強度80%由血小板決定，僅20%由纖維蛋白原決定。纖維蛋白原在整個凝血過程中只起到很小的作用。即便肝素對纖維蛋白原有抑制作用，但在整個血塊強度中表現(xiàn)并不明顯。

本研究采用TEG檢測肝素濃度變化對凝血系統(tǒng)的整體影響，發(fā)現(xiàn)隨著肝素濃度的變化，R、MA、CI、TMA也隨之發(fā)生變化;濃度越高效果越明顯。即TEG參數(shù)的異常變化與肝素濃度變化密切相關(guān)。TEG能完整地動態(tài)監(jiān)測從凝血開始至血凝塊形成及穩(wěn)定的全過程，測定血凝塊生成速度、強度以及血凝塊的穩(wěn)定性。能動態(tài)評估凝血級聯(lián)反應(yīng)相互作用、血小板以及其他血液成分(白細(xì)胞、紅細(xì)胞等)對血漿因子活動的影響，從而全面分析血液凝固的全過程，是整體評價凝血功能最有效手段?？傊?，采用TEG可明確肝素對凝血系統(tǒng)的影響原理，全面反映肝素對凝血因子、血小板聚集功能的抑制作用。對于肝素使用過量、出血風(fēng)險等情況具有很好的臨床預(yù)警價值，在管理肝素使用以及常規(guī)凝血風(fēng)險管理中具有重要作用，為凝血狀態(tài)復(fù)雜患者的應(yīng)對處理可提供更為有效的檢測手段。

［1］Norman R.Skill，drive and luck:the discovery and development of heparin［J］.CMAJ，2011，183(18):2139-2140.

［2］Chavez JJ，F(xiàn)oley DE，Snider CC.A novel thrombelastograph tissue factor/kaolin assay of activated clotting times for monitoring heparin anticoagulation during cardiopulmonary bypass［J］.Anesth Analg，2004，99(5):1290-1294.

［3］Johansson PI，Bochsen L，Stensballe J.Transfusion packages for massively bleeding patients:the effect on clot formation and stability as evaluated by Thrombelastograph(TEG)［J］.Transfus Apher Sci，2008，39(1):3-8.

［4］Park SH，Lee SW，Jeon U，et al.Transcatheter arterial embolization as treatment for a life-threatening retroperitoneal hemorrhage complicating heparin therapy［J］.Korean J Intern Med，2011，26(3):352-355.

［5］Al-Horani RA，Liang A，Desai UR.Designing nonsaccharide，allosteric activators of antithrombin for accelerated inhibition of factor Xa［J］.J Med Chem，2011，54(17):6125-6138.

［6］Bambrah RK，Pham DC.Heparin-induced thrombocytopenia［J］.Clin Adv Hematol Oncol，2011，9(8):594-599.

［7］Daykin HJ，Sturgeon SA，Jones C，et al.Arterial antithrombotic effects of aspirin，heparin，enoxaparin and clopidogrel alone，or in combination，in the rat［J］.Thromb Res，2006，118(6):755-762.

［8］Srensen B，Tang M，Larsen OH.The role of fibrinogen:a new paradigm in the treatment of coagulopathic bleeding［J］.Thromb Res，2011，128(Suppl 1):13-16.