(廣東醫(yī)學(xué)院中美腫瘤研究所，廣東東莞 523808)

鼻咽癌多發(fā)于中國南方及東南亞地區(qū)，其致病因素復(fù)雜，包括病毒感染、遺傳易感及環(huán)境因素［1］。近年來，采用放射治療和新輔助化療相結(jié)合的標準療法，使鼻咽癌治療效果得到顯著改善［2］，但是，其預(yù)后仍然不容樂觀。鼻咽癌具有高侵襲性，早期即可擴散并出現(xiàn)淋巴道或血道轉(zhuǎn)移，治療后的5年生存率只有50% ～60%［3］。研究證實，一個細胞核孤兒受體NR4A家族成員Nurr1主要分布在胞核，其具有促進細胞遷移的作用，其與癌癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性日益受到關(guān)注［4，5］。2011年，我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測了鼻咽癌中Nurr1表達，探討其與鼻咽癌各臨床特征的的關(guān)系，并在細胞水平檢測其對鼻咽癌CNE-2Z細胞遷移及侵襲能力的影響，旨在探討鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2008～2011年收治的首診鼻咽癌患者癌組織石蠟包埋標本66份(觀察組)，患者男4 5例，女21例;年齡23 ～74歲，平均49.5歲。按2008年全國鼻咽癌會議分期標準:T1～T2期26例，T3～T4期40例;N0期16例，N1～N3期50例;M0期61例，M1期5例。Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期48例。另取20例病理活檢為鼻咽黏膜慢性炎癥的非癌標本作為對照組。細胞與試劑:低分化鼻咽癌細胞CNE-2Z(本研究所保存);siRNA-Nurr1序列(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen公司);兔抗人Nurr1多克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司);24孔侵襲小室(Corning Costar公司);DyLight 800遠紅外二抗(KPL公司);其余均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 腫瘤組織Nurr1表達檢測 采用免疫組化SP法:標本脫蠟、水化;PBS洗2～3次各5 min;滴加3%H2O2(80%甲醇)于切片組織上，室溫靜置10 min;PBS洗2～3次各5 min;抗原修復(fù);PBS洗2～3次各5 min;滴加封閉液(1%BSA)，37℃恒溫孵育20 min;甩去多余液體;滴加兔抗人Nurr1多克隆抗體50 μL(1∶50)，37 ℃恒溫孵育1 h;PBS 洗3 次各5 min;滴加生物素標記二抗50 μL(1∶200)，37 ℃恒溫孵育1 h;PBS洗3次各5 min;DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度;PBS或自來水沖洗10 min;蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化;自來水沖洗10～15 min;脫水、透明、封片、鏡檢。觀察兩組細胞胞質(zhì)和胞核中Nurr1表達情況;參照Carcangiu的雙記分法觀察腫瘤組織中Nurr1表達，根據(jù)細胞陽性染色強度記為3分(深棕色)、2分(棕色)、1分(淡棕色)和0分(陰性);根據(jù)陽性細胞數(shù)量多少記為3分(60%以上)、2分(20% ～60%)、1分(20%以下)和0分(陰性)。兩積分的乘積≥4分為高表達，≤3分為低表達或陰性。

1.2.2 siRNA-Nurr1轉(zhuǎn)染CNE-2Z細胞及相關(guān)指標觀察 取CNE-2Z細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、相對飽和濕度下細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞分為三組:A組不處理，B組轉(zhuǎn)染陰性siRNA，C組轉(zhuǎn)染siRNANurr1。轉(zhuǎn)染前調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，接種于6孔板，每孔2 mL，達50% ～60%匯合時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程按試劑盒說明書操作:RNA轉(zhuǎn)染用量為100 pmol/孔，轉(zhuǎn)染試劑 5.0 μL/孔。觀察項目:①細胞Nurr1蛋白表達:轉(zhuǎn)染后48 h裂解細胞提取各組細胞蛋白。用酚試劑法進行定量后，將含有等量蛋白的細胞裂解液用5×上樣緩沖液稀釋，置于SDSPAGE(分離膠10%、濃縮膠5%)電泳分離，濕轉(zhuǎn)至NC膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h;加入一抗(1∶1 000)，4℃過夜;遠紅外波長標記的二抗(1∶15 000)，4 ℃ 孵育 4 h，掃描成像。以 Nurr1/βactin相對灰度值代表Nurr1蛋白相對表達水平。②細胞遷移與侵襲試驗遷移試驗:各組細胞用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成1×106/mL細胞懸液，100 μL細胞懸液加入Transwell上室，下室加入600 μL條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;取出Transwell小室，吸棄上室液體，用棉簽擦去膜上表面細胞，PBS漂洗后4%多聚甲醛固定15 min，Giemsa染色30 min;細胞侵襲試驗使用基質(zhì)膠來模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)環(huán)境，其余過程與遷移試驗相同。隨機取5個視野在200倍顯微鏡下計數(shù)濾膜下表面的細胞數(shù)，用以表示腫瘤細胞的遷移及侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)以±s表示，顯著檢驗采用方差分析;兩因素間差異的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織Nurr1表達、亞細胞分布及與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系 20例鼻咽黏膜非癌組織中有3例為高表達，高表達率為15%;66例鼻咽癌組織中有48例為高表達，高表達率為73%(P＜0.001)。20例鼻咽黏膜非癌組織中只有2例有胞質(zhì)表達，其余18例均只表達于胞核;66例鼻咽癌組織中有41例可見胞質(zhì)表達(P＜0.001)。Nurr1的表達及亞細胞分布與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系見表1。

表1 Nurr1表達、亞細胞分布及與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2 CNE-2Z細胞Nurr1蛋白表達及侵襲、遷移能力 見表2。

表2 siRNA-Nurr1轉(zhuǎn)染CNE-2Z后Nurr1蛋白水平及細胞遷移、侵襲能力變化(n=3，±s)

表2 siRNA-Nurr1轉(zhuǎn)染CNE-2Z后Nurr1蛋白水平及細胞遷移、侵襲能力變化(n=3，±s)

注:與 A、B 組比較，*P ＜0.05

組別 Nurr1蛋白水平 遷移細胞(個) 侵襲細胞(個)A組0.3146 ±0.0188 332 ±21 169 ±12 B 組 0.3208±0.0302 339±24 184±10 C 組 0.1307±0.0180* 285±14* 124±10*

3 討論

NR4A孤兒核受體家族包括3種高度同源的受體:Nur77(NR4A1，也稱 TR3和 NGFI-B)、Nurr1(NR4A2)和Nor1(NR4A3)。這些進化上保守的受體可被環(huán)境中的刺激信號快速誘導(dǎo)，并作為非配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子和早期反應(yīng)基因行使功能［6］。近年來，Nurr1與惡性腫瘤的關(guān)系日益受到關(guān)注，其在鼻咽癌中的作用鮮見報道。免疫組化分析顯示，T、N分期及臨床分期越高，鼻咽癌組織中Nurr1的表達水平也隨之升高。且Nurr1的亞細胞定位亦發(fā)生顯著改變，T、N分期及臨床分期越高，Nurr1的胞質(zhì)表達率越高;細胞侵襲、遷移試驗結(jié)果顯示，siRNANurr1轉(zhuǎn)染后細胞侵襲、遷移能力顯著減弱?？梢奀NE-2Z細胞可能通過升高Nurr1表達及定位改變來促進其惡性演進。

目前Nurr1促進細胞侵襲、遷移的機制尚不清楚。作為一個重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其本身的表達水平改變可導(dǎo)致其調(diào)控的一系列基因的表達變化，進而促進腫瘤的惡性演進。有研究表明，NR4A家族的另一成員Nur77，經(jīng)MEK-ERK-RSK途徑被磷酸化后，由細胞核轉(zhuǎn)位到線粒體，與抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合，使Bcl-2的BH3結(jié)構(gòu)域暴漏，誘發(fā)線粒體途徑的凋亡［7，8］。我們推測，Nurr1可能有類似的機制，只不過胞質(zhì)中還存在非線粒體結(jié)合的Nurr1，兩者互相制約，使平衡趨向于有利于鼻咽癌細胞存活和侵襲的方向發(fā)展。

總之，本研究證明了Nurr1是一個嶄新的影響鼻咽癌惡性特征的蛋白分子，其表達水平及在胞質(zhì)的錯位分布可能成為判定鼻咽癌惡性程度及預(yù)后的分子生物學(xué)指標。作為鼻咽癌防治的潛在靶點，有必要對其影響鼻咽癌的分子機制進行更深入的研究。

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