謝丹丹，張 雷，尹 青，馮 倩

(1河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊 050017;2河北醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

P19細(xì)胞是一種小鼠的畸胎瘤細(xì)胞，通過條件培養(yǎng)可分化為包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中，其細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)及電生理學(xué)特征基本模擬了正常小鼠心肌發(fā)育過程［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，心肌微環(huán)境比單純化學(xué)誘導(dǎo)更為重要，提示心肌細(xì)胞裂解液有可能較好的誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。2011年11月～2012年2月，我們觀察了心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化的效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 新生1～3 d SD大鼠，小鼠P19細(xì)胞系(本實(shí)驗(yàn)室保存)，胎牛血清(Clark公司)，新生牛血清(PAA公司)，鼠抗人心肌肌鈣蛋白T單克隆抗體(cTnT，Abcam公司)，兔抗人連接蛋白43多克隆抗體(Cx43，中杉金橋)，β-actin(Stana Cruz公司)。

1.2 P19細(xì)胞分組及處理 將復(fù)蘇后傳代4代以上的P19細(xì)胞，以5×105/mL密度接種在鋪有低熔點(diǎn)瓊脂糖的6孔板中培養(yǎng)4 d，形成細(xì)胞聚集體。常規(guī)分離SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，將生長(zhǎng)較好的原代心肌細(xì)胞制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，迅速置于－70℃冰箱內(nèi)，4～5 h后取出融化，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞懸液，如此反復(fù)3次后，將細(xì)胞懸液離心，取上清液過濾即為心肌細(xì)胞裂解液。心肌細(xì)胞按4×105/mL接種于含10%FBS的完全培養(yǎng)基中，收集每日更換所得的培養(yǎng)基離心，DMEM高糖培養(yǎng)取上清液與培養(yǎng)基1∶1混合，即為心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液。將聚集4 d生長(zhǎng)較好，形態(tài)規(guī)則、大小較一致的細(xì)胞聚集體吸出，以同等數(shù)量加入心肌細(xì)胞裂解液、心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液及完全培養(yǎng)基中，分別為A、B、C組。待細(xì)胞貼壁后，每天更換新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

1.3 定向誘導(dǎo)效果評(píng)價(jià)

1.3.1 細(xì)胞中cTnT的檢測(cè) 采用免疫組化SP法。分別取各組7、10 d的細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，按免疫組化SP法進(jìn)行染色。一抗為cTnT抗體。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)者為cTnT陽性細(xì)胞。

1.3.2 cTnT、Cx43的定量檢測(cè) 分別取各組7、10 d的細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取后定量，制成凝膠上樣標(biāo)本，經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，PVDF膜轉(zhuǎn)移，cTnT(1∶1 000)和 Cx43(1∶400)進(jìn)行免疫反應(yīng)，電化學(xué)法顯色。底片經(jīng)掃描儀透掃后，用Image J軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行定量分析，以β-actin作為內(nèi)參，用目的蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

P19細(xì)胞懸浮培養(yǎng)4 d形成球形聚集體后貼壁培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化。A組4 d后邊緣有部分細(xì)胞爬出，7 d后邊緣爬出細(xì)胞體積變大，細(xì)胞核增大。10 d后體積變大的細(xì)胞增多，細(xì)胞伸展，突起長(zhǎng)。B組有少量細(xì)胞發(fā)生變化，C組細(xì)胞無明顯改變。

A、B、C組 cTnT陽性細(xì)胞率分別為 5.0%、2.4%、0，A 組 ＞B 組＞C 組(P均 ＜0.05)。三組培養(yǎng)7、10 d細(xì)胞cTnT、Cx43相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1 三組培養(yǎng)7、10 d細(xì)胞cTnT、Cx43相對(duì)表達(dá)量比較( ±s)

表1 三組培養(yǎng)7、10 d細(xì)胞cTnT、Cx43相對(duì)表達(dá)量比較( ±s)

注:與C組同一時(shí)間相比，*P＜0.05;與B組同一時(shí)間相比，△P ＜0.05

組別cTnT Cx43 A 組培養(yǎng)7 d 1.339 ±0.831＊△ 1.227 ±0.025＊△培養(yǎng)10 d 1.861 ±0.120＊△ 1.780 ±0.089＊△B組培養(yǎng)7 d 1.098 ±0.220* 1.029 ±0.040*培養(yǎng)10 d 1.690 ±0.626* 1.583 ±0.138*C組培養(yǎng)7 d 0.019 ±0.052 0.017 ±0.026培養(yǎng)10 d 0.170 ±0.035 0.097 ±0.023

3 討論

心肌環(huán)境對(duì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化有重要作用。心肌環(huán)境包括體內(nèi)心肌環(huán)境或體外“心肌樣”環(huán)境［2］。有學(xué)者用心肌細(xì)胞裂解液和心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液分別對(duì)胚胎干細(xì)胞(ESCs)進(jìn)行誘導(dǎo)［3］，結(jié)果顯示，兩種方法均可在體外模擬心肌微環(huán)境［4，5］，誘導(dǎo)ESCs向心肌樣細(xì)胞分化。有學(xué)者使用催產(chǎn)素［6～9］聯(lián)合乳鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)ESCs分化，結(jié)果表明，ESCs分化的心肌細(xì)胞與正常心肌細(xì)胞一樣，在細(xì)胞膜上存在腎上腺素受體、膽堿能受體和Ca2+通道［10］，分化的早期對(duì)異丙腎上腺素、乙酰膽堿和維拉帕米的反應(yīng)性均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，分化晚期隨著心肌細(xì)胞逐漸發(fā)育成熟，細(xì)胞對(duì)藥物作用的反應(yīng)性增強(qiáng)，提示心肌細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可能有促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的作用［11］。本實(shí)驗(yàn)采用心肌細(xì)胞裂解液及心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液模擬體外心肌微環(huán)境，便于在體外對(duì)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化進(jìn)行直接而方便的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察。

cTnT是僅存在于心肌細(xì)胞中的特異性調(diào)節(jié)蛋白，主要存在于心肌收縮單位中肌原纖維的細(xì)肌絲上。Cx43是心肌縫隙連接中的主要蛋白，Cx43陽性說明心肌細(xì)胞間具有形成閏盤結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)［12～14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A組即心肌細(xì)胞裂解液組和B組即條件培養(yǎng)液組細(xì)胞中均有cTnT和Cx43的表達(dá)。同時(shí)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞裂解液中P19細(xì)胞的cTnT和Cx43表達(dá)強(qiáng)于心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液中的細(xì)胞，提示通過反復(fù)凍融裂解所得到的心肌細(xì)胞裂解液含有一些具有誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化功能的物質(zhì)，而這些物質(zhì)在心肌細(xì)胞裂解液中的濃度比條件液中高;或是具有誘導(dǎo)作用的物質(zhì)在正常的心肌細(xì)胞內(nèi)，但不能被分泌到細(xì)胞外間隙，只有心肌細(xì)胞裂解后才能被釋放［15］。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞裂解液對(duì)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化具有明顯的誘導(dǎo)作用，且實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)，其誘導(dǎo)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］van der Heyden MA，van Kempen MJ，Tsuji Y，et al.P19 embryonal carcinoma cells:a suitable model system for cardiac electrophysiological differentiation at the molecular and functional level［J］.Cardiovasc Res，2003，58(2):410-422.

［2］歐東波，陳瑞，鄭強(qiáng)蓀.胚胎干細(xì)胞在體外模擬心肌生長(zhǎng)環(huán)境中向心肌分化［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9(4):622-626.

［3］李衛(wèi)東，張曉剛，蔣芳萍.心肌細(xì)胞裂解液或心肌細(xì)胞對(duì)胚胎干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)作用［J］.中華心血管病雜志，2006，36(5):540.

［4］Graichen R，Xu X，Braam SR，et al.Enhanced cardiomyogenesis of human embryonic stem cells by a small molecular inhibitor of p38 MAPK［J］.Differentiation，2008，76(4):357-370.

［5］Singla DK，Hacker TA，Ma L，et al.Transplantation of embryonic stem cells into the infarcted mouse heart:formation of multiple cell types［J］.J Mol Cell Cardiol，2006，40(1):195-200.

［6］Jankowski M，Danalache B，Wang D，et al.Oxytocin in cardiac ontogeny［ J］ .Proc Nat l Acad Sci USA，2004，101(35):130742-130791.

［7］Paquin J，Danalache BA，Jankowski M，et al.Oxytocin induces different iation of P19 emb ryon ic stem cel ls to card iom yocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(14):9550-9555.

［8］Katsuhisa M，Toshio N，Nobuhiro N，et al.Adult cardiacscal-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes［J］.J Biol Chem，2004，279(12):11384-11391.

［9］陳煒，尹青，張雷.催產(chǎn)素誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的作用［J］.解剖學(xué)報(bào)，2008，4(39):611-613.

［10］Snir M，Kehat I，Gepstein A，et al.Assessm ent of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell derived cardiomyocytes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(6):2355-2363.

［11］滕繼偉，鄭強(qiáng)蓀，歐東波.催產(chǎn)素聯(lián)合乳鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的作用［J］.心臟雜志，2010，22(4):500-505.

［12］Jongsma HJ，Wilders R.Gap junction in cardiovascular disease［J］.Circ Res，2000，86(12):1193-1197.

［13］Chen P，Huang GY，Chang C，et al.Spat io temporal expression of CX43 in the developing humanand mouse hearts［J］.Acta Lab An Sci Sinica，2005，13(1):16-19.

［14］陳萍，黃國英，常才，等.Cx43基因在人類及小鼠胎心發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，13(1):16-19.

［15］袁巖，陳連鳳，張抒揚(yáng).心肌微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用［J］.中國介入心臟病學(xué)雜志，2005，13(5):315-318.