曹成珠，靳國(guó)恩，舒星宇，李生花

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001;2南京人口管理干部學(xué)院)

近年來(lái)，高原急慢性低氧對(duì)機(jī)體的影響備受關(guān)注。人進(jìn)入高原低氧環(huán)境后，體內(nèi)發(fā)生一系列變化，低氧干擾了機(jī)體的氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞代謝和功能紊亂。高原低氧可使血液中促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血紅蛋白(Hb)水平升高，紅細(xì)胞(RBC)數(shù)量增多，從而增加氧的運(yùn)輸與釋放，這在應(yīng)對(duì)高原缺氧中具有重要意義。但紅細(xì)胞比容(Hct)過(guò)高則會(huì)顯著增加血液黏滯度，使血流緩慢，氧的傳遞受阻，反而加重組織缺氧。二十味沉香丸是在八味沉香丸基礎(chǔ)上改良而來(lái)的組方，其除了對(duì)腦細(xì)胞有很好的保護(hù)作用外，還能改善心肌缺血，對(duì)缺氧性心肌勞損也有一定的防治作用。2010年1月～2012年6月，本研究通過(guò)觀察二十味沉香丸對(duì)高原低壓低氧暴露大鼠Hb、Hct及血清EPO表達(dá)的影響，并探討其意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性Wistar大鼠165只，約45 d齡，體質(zhì)量(180±30)g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(111)2009-09］。試劑及儀器:25%烏拉坦(江蘇東邦醫(yī)藥化工有限公司)，ELISA試劑盒 (美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將165只大鼠由成都空運(yùn)至西寧(海拔2 260 m)，隨機(jī)分為平原對(duì)照組(15只)、高原對(duì)照組(75只)和高原給藥組(75只)。平原對(duì)照組到達(dá)西寧即刻檢測(cè)Hb、Hct，采集血清并液氮儲(chǔ)存;高原對(duì)照組和高原給藥組大鼠從西寧直接運(yùn)至海拔4 500 m(果洛州花石峽鎮(zhèn))地區(qū)。高原對(duì)照組用0.9%生理鹽水灌胃，高原給藥組用二十味沉香丸制成的水劑(根據(jù)人的用量換算成大鼠的量，1 mL/100 g)灌胃。高原對(duì)照組、高原給藥組分別于1、3、7、15、30 d，各取 15 只大鼠，測(cè)定大鼠體質(zhì)量、Hb、Hct，之后立即處死動(dòng)物，收集血清，液氮保存。用ELISA法檢測(cè)血清EPO。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，行多組方差分析，相關(guān)性分析用Pearson法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低壓低氧暴露不同時(shí)間三組大鼠Hb、Hct、血清EPO表達(dá)變化 平原對(duì)照組 Hb、Hct分別為(15.8 ±1.2)g/L 、54.89% ±2.5%。高原對(duì)照組大鼠高原暴露第3、7、15、30 天 Hb、Hct水平較平原對(duì)照組有所升高，但明顯低于高原給藥組(P均＜0.05)。詳見(jiàn)表1。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，高原對(duì)照組大鼠血清EPO表達(dá)逐步升高。平原對(duì)照組血清EPO水平為14.5 ng/mL，高原給藥組血清EPO一直維持在較低的水平，在暴露15 d左右略有升高(P＜0.05)，但30 d時(shí)又恢復(fù)至正常水平。詳見(jiàn)表2。

表1 暴露不同時(shí)間高原對(duì)照組與高原給藥組大鼠Hb、Hct變化(±s)

表1 暴露不同時(shí)間高原對(duì)照組與高原給藥組大鼠Hb、Hct變化(±s)

注:與高原給藥組相比，*P＜0.05

組別 Hb(g/L)第1天 第3天 第7天 第15天 第30天Hct(%)第1天 第3天 第7天 第15天 第30天高原對(duì)照組 15.7 ±0.6 16.3 ±0.9*16.4 ±0.78*18.8 ±0.4*22.8 ±2.0* 56.42 ±1.4 57.72 ±2.2*57.80 ±1.9*63.6 ±0.9*65.40 ±4.1*高原給藥組 15.4 ±1.4 15.7 ±1.1 15.9 ±0.54 16.4 ±0.6 16.2 ±1.1 55.72 ±2.4 56.22 ±2.5 54.78 ±1.48 58.23 ±1.457.33 ±1.2

表2 暴露不同時(shí)間高原對(duì)照組與高原給藥組血清EPO 表達(dá)變化(ng/mL，±s)

表2 暴露不同時(shí)間高原對(duì)照組與高原給藥組血清EPO 表達(dá)變化(ng/mL，±s)

注:與高原對(duì)照組相比，*P＜0.05

組別EPO第1天 第3天 第7天 第15天 第30天高原對(duì)照組 14.9 ±0.6 15.9 ±0.8 17.6 ±0.8 19.8 ±0.3 20.0 ±1.1高原給藥組 14.8 ±1.0 15.0 ±1.0 14.1 ±0.5* 16.2 ±0.5* 15.1 ±0.9*

2.2 高原對(duì)照組大鼠Hb與血清EPO表達(dá)的相關(guān)性 高原對(duì)照組大鼠血清中EPO表達(dá)水平與Hb呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.83，P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 高原對(duì)照組大鼠Hb與血清EPO表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

研究證實(shí)，血液系統(tǒng)Hb，Hct和EPO是慢性低氧反應(yīng)最敏感的指標(biāo)，主要表現(xiàn)為骨髓造血增強(qiáng)，RBC增多，Hb含量增加，血清EPO表達(dá)升高，進(jìn)一步提高RBC數(shù)量和Hb的濃度，從而增加氧的運(yùn)輸與釋放［1］。如果Hct過(guò)高則顯著增加血液黏滯度，使氧的傳遞受阻，反而加重組織缺氧。至于低氧可刺激大鼠 Hb、Hct升高的原因，多認(rèn)為與 HIF-1-EPO-RBC調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)。HIF-1α作為調(diào)控氧穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)維持機(jī)體氧平衡和適應(yīng)低氧環(huán)境具有關(guān)鍵作用［2］。EPO是一種相對(duì)分子量為34 000、受缺氧調(diào)節(jié)的糖蛋白激素，在調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成和成熟過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，能發(fā)揮多種旁分泌和自分泌功能。EPO對(duì)紅細(xì)胞生成的作用可歸結(jié)為:①刺激有絲分裂，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖;②激活紅系特異基因，誘導(dǎo)分化;③加速網(wǎng)織紅細(xì)胞的釋放和提高紅細(xì)胞膜的抗氧化功能。此外，EPO還有抗氧化、穩(wěn)定紅細(xì)胞膜的作用，對(duì)多向祖細(xì)胞(CFUGEMM)、巨核系祖細(xì)胞(CFU，Meg)、粒單系祖細(xì)胞(CFU-GM)也有一定的刺激作用。EPO的產(chǎn)生受氧分壓的調(diào)控，決定其合成的主要因素是EPO基因在肝和腎的轉(zhuǎn)錄活性，而HIF-1α控制這一過(guò)程。以往的研究已證實(shí)，EPO基因序列中含有與HIF-1α相結(jié)合的區(qū)域，即低氧反應(yīng)元件，HIF-1α能激活EPO基因的表達(dá)，EPO進(jìn)而促進(jìn)RBC增殖。

藏藥二十味沉香丸經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用，在高血壓、冠心病、心律失常、偏癱、神志紊亂、口眼歪斜、四肢麻木、失眠等心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面顯示了獨(dú)特的療效，是最常用的藏藥之一。本研究中，高原對(duì)照組大鼠暴露于低壓低氧后，其Hb、Hct水平顯著升高，并隨著高原暴露時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)增高，這與以往研究結(jié)果［1］一致。但在高原給藥組二者增高并不明顯，與平原對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異，表明二十味沉香丸能抑制RBC過(guò)度增殖，降低血液黏滯度，加快氧傳遞速度和氧利用效率，從而起到機(jī)體抗缺氧的效果。這與其活血化瘀、改善血液循環(huán)的藥理特性相符合［3～6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，高原對(duì)照組大鼠血清EPO表達(dá)與Hb水平呈正相關(guān)關(guān)系，表明在高原低氧環(huán)境下Hb的升高主要與EPO的高表達(dá)有關(guān)。高原對(duì)照組大鼠血清EPO表達(dá)在暴露第1天略上升，第3天后隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)，而高原給藥組血清EPO表達(dá)在暴露15 d左右略有升高，但30 d時(shí)又恢復(fù)至正常水平，表明低氧暴露初期EPO的升高與機(jī)體低氧應(yīng)激有關(guān)，長(zhǎng)期低氧引起EPO表達(dá)輕微下降，是機(jī)體或細(xì)胞適應(yīng)低氧的表現(xiàn)。高原給藥組血清EPO表達(dá)水平明顯低于高原對(duì)照組，提示二十味沉香丸對(duì)EPO表達(dá)有抑制作用。推測(cè)該藥可能是通過(guò)干預(yù)HIF-EPO-RBC信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制EPO表達(dá)，使Hb水平在高原低氧時(shí)有所增加，增強(qiáng)Hb的攜氧能力，但不增加血液黏滯度，從而改善組織缺氧，促使機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境［7～9］。

綜上所述，二十味沉香丸可能是通過(guò)降低血清EPO表達(dá)，降低低壓低氧暴露下大鼠的Hb和Hct，起到抗缺氧的效果，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。

［1］靳國(guó)恩，張偉，楊應(yīng)忠，等.十五味沉香散等5種藏藥抗慢性缺氧的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中草藥，2007，38(1):95-97.

［2］李生花.與低氧反應(yīng)相關(guān)的氧感受器研究進(jìn)展［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32(8):889-891.

［3］劉震東，宋淼，達(dá)番瓊，等.藏藥二十味沉香丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2003，18(6):462-464.

［4］邢英琦，徐靜，李琳，等.缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)與靶基因研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15(1):177-179.

［5］馮玫，李玉翠.EPO與EPO受體的研究進(jìn)展［J］.白血病，2005，14(4):254-256.

［6］楊應(yīng)忠，嘎琴，郭志堅(jiān)，等.高原低氧對(duì)大鼠血液HIF-1α含量和組織器官COX表達(dá)的影響［J］.青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32(3):155-158.

［7］Hamdan MA，Abu-Sulaiman RM，Najm HK.Sildenafil in pulmonary hypertension secondary to unilateral agenesis of pulmonary artery［J］.Pediatric Cardiol，2006，27(2):279-281.

［8］Katrina F.Pulmonary artery hypertension:new drug treatment in children［J］.Arch Dis Child Ed Pract，2005，90(5):15-20.

［9］ Pereira BN.Bosentan for Pulmonary Hypertension［J］.NEJM，2002，347(4):292-294.