甘 露，肖小敏△，魏 明

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510632;2西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710021)

我國(guó)是乙型肝炎的流行病區(qū)。在圍生期和嬰幼兒時(shí)期感染乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)者中，分別有90%和25% ～30%將發(fā)展成慢性感染［1］，其成年后發(fā)生肝硬化甚至肝癌的幾率明顯增加，因此阻斷HBV宮內(nèi)傳播已成為圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和傳染病學(xué)亟待解決的問(wèn)題。目前產(chǎn)前阻斷HBV母嬰傳播的方法是在孕晚期應(yīng)用乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)，但臨床上對(duì)其效果尚存在爭(zhēng)議。胎盤是病毒宮內(nèi)傳播發(fā)生的關(guān)鍵部位，胎盤屏障的第一層細(xì)胞是滋養(yǎng)層細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞被廣泛用作病毒宮內(nèi)傳播的靶細(xì)胞。來(lái)源于胎盤滋養(yǎng)層的絨毛癌細(xì)胞，與滋養(yǎng)層細(xì)胞特性功能基本相似。BeWo和JAR細(xì)胞，作為已建立的絨毛癌細(xì)胞系，目前被廣泛用作代表胎盤屏障的滋養(yǎng)層細(xì)胞模型［2－4］。因此本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度的 HBIG(103、102、10、1、0.1 IU/L)作用于HBV感染的人絨毛膜癌細(xì)胞系JAR細(xì)胞，探討其在體外阻斷HBV感染JAR細(xì)胞的作用。

材料和方法

1 細(xì)胞來(lái)源

以源于滋養(yǎng)層細(xì)胞的人絨毛膜癌細(xì)胞系JAR細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞模型，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 主要試劑

HBV血清為2009年收集的乙肝患者HBV陽(yáng)性血清，ELISA檢測(cè)乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙肝 e 抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙肝核心抗體(hepatitis B core antibody，anti－HBc)均為陽(yáng)性，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)血清HBV－DNA滴度為5×1011copies/L，無(wú)合并甲、丙、丁、戊肝的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，使用前用無(wú)血清 RPMI－1640，1∶5 稀釋，并通過(guò)0.22 μm 孔徑濾器過(guò)濾除菌，分裝，置于－80℃保存。陰性血清為體檢正常人的外周血血清，同上處理。HBIG購(gòu)自四川遠(yuǎn)大蜀陽(yáng)藥業(yè)有限公司;RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco;鼠抗人HBsAg單克隆抗體(Ⅰ抗)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)自北京中杉金橋生物工程公司;人類基因組DNA提取和純化試劑盒:Biospin Cell Genomic DNA Extraction Kit(離心柱型，Cat:BSC0531)購(gòu)自BioFlux;乙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒(Cat.#DA－D051)購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 MTT比色法 檢測(cè)不同濃度的HBIG(終濃度分別為 103IU/L、102IU/L、10 IU/L、1 IU/L、0.1 IU/L)對(duì)JAR細(xì)胞的作用。取適量用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度至108/L，取100 μL接種至96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為104個(gè)，每組6孔。將96孔板放回CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到板面積70%，分別加入不同濃度的HBIG，陰性對(duì)照組不加HBIG，空白對(duì)照孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h，于24 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入 DMSO 150 μL，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上選擇測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，參照波長(zhǎng)為630 nm，測(cè)定各孔吸光度(A值)。各組A值=各組測(cè)得的A值－空白組A值均值。

3.2 細(xì)胞內(nèi)DNA提取及熒光定量PCR檢測(cè)HBV－DNA HBV血清感染體外培養(yǎng)的JAR細(xì)胞，不同濃度的 HBIG(終濃度為 103、102、10、1、0.1 IU/L)干預(yù)，24 h后采用BioFlux公司人類基因組DNA提取和純化試劑盒提取、純化細(xì)胞內(nèi)DNA，按試劑盒操作。采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司HBV核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行HBV－DNA檢測(cè)，按試劑盒操作。

3.3 細(xì)胞免疫熒光染色法 制作細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長(zhǎng)滿片的50%，加入HBV陽(yáng)性血清孵育，24 h后取出細(xì)胞爬片，PBS洗5 min共12次。室溫下，4%多聚甲醛固定20 min;用PBS洗5 min共3次;0.3%Triton X－100室溫處理5 min;PBS洗，10 min共3次;山羊封閉血清室溫封閉1 h，不洗;加入1∶50稀釋的鼠抗人HBsAg單克隆抗體(Ⅰ抗)，4℃過(guò)夜;PBS洗10 min，共3次;加入1∶100稀釋FITC標(biāo)記的Ⅱ抗，37℃避光孵育1 h;PBS洗10 min，共3次;加入DAPI，室溫避光孵育5 min;PBS洗5 min，共2次;甘油封片，4℃避光保存30 min;激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較用SNK檢驗(yàn)或Tamhane's T2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT結(jié)果

各濃度HBIG組的A值與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明此次設(shè)定的各個(gè)濃度的HBIG對(duì)JAR細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度HBIG對(duì)JAR細(xì)胞生長(zhǎng)作用Table 1.The growth of JAR cells in different groups(.n=6)

表1 不同濃度HBIG對(duì)JAR細(xì)胞生長(zhǎng)作用Table 1.The growth of JAR cells in different groups(.n=6)

HBIG 103IU/L 0.56 ±0.16 HBIG 102IU/L 0.58 ±0.16 HBIG 10 IU/L 0.54 ±0.11 HBIG 1 IU/L 0.56 ±0.12 HBIG 0.1 IU/L 0.52 ±0.11 Negative control 0.56 ±0.14

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

以不同濃度HBIG培養(yǎng)的各組細(xì)胞內(nèi)均檢測(cè)到HBV－DNA的存在，但各組之間的HBV－DNA拷貝數(shù)沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組均為陰性，見(jiàn)表2。

3 免疫細(xì)胞熒光染色法

通過(guò)激光共聚焦顯微鏡，在JAR細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)檢測(cè)到HBsAg免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)(綠色)，呈片狀或團(tuán)塊狀分布。特別的是在細(xì)胞核的邊上HBsAg免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)呈點(diǎn)狀分布，且熒光較強(qiáng)，如戒指結(jié)構(gòu)。在第1組到第6組各組中，無(wú)論加入HBIG終濃度的高低，均可在JAR細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)檢測(cè)到HBsAg免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)，見(jiàn)圖1。隨機(jī)抽取10個(gè)不同視野，進(jìn)行拍照。每個(gè)視野圈定10個(gè)以上的細(xì)胞。利用軟件對(duì)圈定的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行熒光灰度分析。各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)HBsAg熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)HBsAg熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各實(shí)驗(yàn)組之間比較，細(xì)胞內(nèi)HBsAg熒光強(qiáng)度差異無(wú)顯著(P ＞ 0.05)，見(jiàn)表3。

表2 不同組JAR細(xì)胞內(nèi)HBV－DNA拷貝數(shù)Table 2.The copies of HBV－DNA in JAR cells in different groups(.n=4)

表2 不同組JAR細(xì)胞內(nèi)HBV－DNA拷貝數(shù)Table 2.The copies of HBV－DNA in JAR cells in different groups(.n=4)

aThe numbers were logarithmically transformed.P ＞0.f05.

Group HBV－DNA copiesa HBV+HBIG 103IU/L 4.80 ±0.56 HBV+HBIG 102IU/L 5.00 ±0.62 HBV+HBIG 10 IU/L 5.00 ±0.54 HBV+HBIG 1 IU/L 5.10 ±0.83 HBV+HBIG 0.1 IU/L 4.89 ±0.65 HBV 5.04 ±0.70 Negative control ＜3 Blank control ＜3

討 論

目前臨床尚對(duì)孕晚期應(yīng)用HBIG阻斷HBV宮內(nèi)傳播的效果尚存在爭(zhēng)議。一部分研究者認(rèn)為孕晚期使用HBIG對(duì)阻斷HBV母嬰傳播有效［5］。而一部分學(xué)者認(rèn)為新生兒出生后常規(guī)主被動(dòng)免疫，已經(jīng)能阻斷大部分的HBV母嬰傳播，孕晚期使用HBIG性價(jià)比不高，甚至是沒(méi)有阻斷效果。張平等［6］按使用HBIG情況分組觀察使用效果，發(fā)現(xiàn)孕期使用HBIG對(duì)阻斷宮內(nèi)感染無(wú)效。朱科倫等［7］對(duì)HBV陽(yáng)性孕婦于孕28周后每月接種HBIG 200 IU，定期檢測(cè)孕婦血HBsAg、HBV－DNA和 HBsAb，發(fā)現(xiàn) HBsAg和HBV－DNA無(wú)明顯降低，HBsAb無(wú)明顯升高，認(rèn)為HBV陽(yáng)性孕婦孕期注射的HBIG劑量尚未能完全中和孕婦血清中的HBV，HBIG中和病毒的作用和效果尚值得懷疑。

Figure 1.The localization of HBsAg was examined by laser scanning confocal microscopy(×400).HBsAg(green)was found in JAR cells in the test groups.HBsAg was located in the cytoplasm or at the edge of the nucleus(blue).a1－c1:HBV+103IU/L HBIG;a2－c2:HBV+102IU/L HBIG;a3－c3:HBV+10 IU/L HBIG;a4－c4:HBV+1 IU/L HBIG;a5－c5:HBV+0.1 IU/L HBIG;a6－c6:HBV;a7－c7:blank control(fetal bovine serum);a8－c8:negative control(healthy people serum).圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HBsAg的定位

表3 不同組JAR細(xì)胞內(nèi)HBsAg熒光強(qiáng)度Table 3.The HBsAg expression in JAR cells in different groups(.n=100)

表3 不同組JAR細(xì)胞內(nèi)HBsAg熒光強(qiáng)度Table 3.The HBsAg expression in JAR cells in different groups(.n=100)

*P ＜0.05 vs HBV group.

Group Fluorescent intensity HBV+HBIG 103IU/L 583.14 ±116.85 HBV+HBIG 102IU/L 581.90 ±69.13 HBV+HBIG 10 IU/L 582.26 ±107.46 HBV+HBIG 1 IU/L 576.24 ±118.22 HBV+HBIG 0.1 IU/L 583.79 ±118.56 HBV 615.28 ±134.59 Negative control 275.91 ±48.26*Blank control 295.43 ±44.50*

針對(duì)孕晚期使用HBIG的爭(zhēng)議，HBV病毒血清體外感染細(xì)胞的可能性，我們采用高病毒載量的HBV－DNA陽(yáng)性血清感染體外培養(yǎng)的JAR細(xì)胞，模擬母胎界面，應(yīng)用不同濃度的HBIG去干預(yù)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的HBV－DNA拷貝數(shù)的差異。HBV－DNA陽(yáng)性直接反應(yīng)了病毒的復(fù)制水平，同時(shí)也提示宿主具有傳染性。目前，臨床上認(rèn)為HBIG濃度至少達(dá)到10 IU/L才有保護(hù)作用［8］。因此本次實(shí)驗(yàn)設(shè)定5個(gè)HBIG 的濃度，分別為 103、102、10、1、0.1 IU/L。其中前2個(gè)濃度高于最低保護(hù)濃度，后2個(gè)濃度低于最低保護(hù)濃度。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(正常人血清)和空白對(duì)照組(胎牛血清)。

首先，采用MTT法檢測(cè)各濃度HBIG對(duì)JAR細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果利用單因素方差分析得出P＞0.05，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)設(shè)定的各濃度的HBIG對(duì)JAR細(xì)胞生長(zhǎng)的差異無(wú)顯著?？梢赃M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在與HBV陽(yáng)性血清共同孵24 h后提取JAR細(xì)胞內(nèi)的DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV－DNA的拷貝數(shù)，得出各組細(xì)胞內(nèi)均檢測(cè)到HBV－DNA的存在，但各組之間的HBV－DNA的拷貝數(shù)沒(méi)有顯著差異。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組均為陰性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果提示，較高濃度的HBIG組(終濃度為103IU/L和終濃度為102IU/L)的JAR細(xì)胞內(nèi)的HBV－DNA拷貝數(shù)與第6組(只加病毒)的JAR細(xì)胞內(nèi)的HBV－DNA拷貝數(shù)相比無(wú)顯著差異;激光共聚焦顯微鏡結(jié)果也提示這2組細(xì)胞內(nèi)HB-sAg熒光強(qiáng)度與第6組相比無(wú)顯著差異。這說(shuō)明在體外條件下高于最低保護(hù)濃度的10倍、100倍濃度的抗體也并不能阻斷HBV感染JAR細(xì)胞。

Partovi等［9］用非房室模型計(jì)算肌注HBIG的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如果肌注HBIG的患者抗HBs滴度300 IU/L可以3周后再注射，如果滴度在200～300 IU/L之間3周內(nèi)注射，滴度在151～200 IU/L之間2周注射，滴度在100～151 IU/L需1周內(nèi)注射，而滴度小于100 IU/L應(yīng)立即注射。對(duì)于HBsAg滴度較高者注射HBIG后，由于中和作用，抗HBs滴度將較快降低而難以維持在有效濃度。此研究提示若不管HBsAg、HBeAg和HBV－DNA濃度的差別，一律于孕晚期注射3次HBIG 200 IU可能是不合理的。

而孫玉革等［10］對(duì)慢性攜帶HBV的孕婦于孕晚期注射HBIG 200或400 IU。動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果顯示，無(wú)論在注射后24 h、72 h、1周、2周、4周，還是3次注射結(jié)束后l周，HBV－DNA水平和注射前比較均無(wú)下降趨勢(shì)，無(wú)顯著差異(均P＞0.05)。此研究說(shuō)明注射小劑量HBIG后的各個(gè)時(shí)段都不會(huì)對(duì)HBVDNA水平產(chǎn)生影響，注射HBIG前后HBV標(biāo)志物無(wú)變化，更無(wú)anti－HBs檢出。

結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)，高于臨床最低保護(hù)濃度的抗體并不能阻斷HBV感染JAR細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為目前在臨床上孕晚期應(yīng)用200 IU HBIG直接阻斷乙肝病毒感染滋養(yǎng)細(xì)胞的途徑值得懷疑，孕期應(yīng)用HBIG是否還能通過(guò)其它途徑阻斷宮內(nèi)HBV傳播則有待進(jìn)一步研究。

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