鐘 華， 胡清華， 王恩幫， 趙 丹， 孫志萍， 司軍強， 何 芳△

(1 新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子大學醫(yī)學院2 病理生理教研室，3醫(yī)學機能實驗中心，新彊 石河子832002;4 華中科技大學同濟醫(yī)學院病理生理學系，衛(wèi)生部呼吸系疾病重點實驗室，湖北 武漢430030;5 鄖陽醫(yī)學院生理學教研室，湖北 十堰442000)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、遷移和表型變化導致的血管壁增厚和血管緊張度增加是高血壓發(fā)病的關鍵。由縫隙連接蛋白(connexin，Cx)構成的細胞間直接通訊——縫隙連接(gap junction，GJ)在調節(jié)血管舒縮、血管平滑肌細胞增殖、平滑肌表型轉變中起著重要作用，并與高血壓發(fā)生密切相關［1］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF - β1)血漿水平升高與高血壓的發(fā)生密切相關［2］，在已研究證實的機制中均涉及細胞間通訊方式［2-4］。TGF-β1血漿水平升高是否通過改變Cx 的表達并調節(jié)縫隙連接通道的功能，影響細胞間直接通訊，導致血管平滑肌細胞增殖有待證實。基于上述情況，本研究以TGF-β1與自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)血管平滑肌細胞共孵育為細胞模型，配合使用縫隙連接通道的阻斷劑18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid，18α-GA)，應用染料示蹤分子傳遞法、Western blotting、免疫熒光染色、流式細胞術和MTT 法，觀察不同干預條件下縫隙連接蛋白表達和縫隙連接功能變化及對SHR 血管平滑肌細胞增殖的影響，闡明縫隙連接在TGF -β1誘導的SHR血管平滑肌細胞增殖中的作用及分子機制，為高血壓的防治提供新靶標。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

1.1 材料 3 ～10 周齡，150 ～200 g 自發(fā)性高血壓大鼠，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物有限責任公司，許可證號為SCXK(京)2007 -0001。

1.2 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清/小牛血清(HyClone)，胰蛋白酶(Sigma)，TGF - β1(Sigma)，18α-GA(Sigma)，抗α -actin 單克隆抗體(Dako)，抗Cx40 單克隆抗體(Invitrogen)，抗Cx43單克隆抗體(Invitrogen)，羅氏黃(lucifer yellow，LY;Molecular Probes)，羅丹明-葡聚糖(rhodamine-dextran，RD;Molecular Probes)，發(fā)光試劑盒(Pierce)。

2 方法

2.1 VSMCs 的培養(yǎng)和鑒定 取3 ～10 周齡，150 ～200 g 自發(fā)性高血壓大鼠，雌雄不限，斷頭處死。無菌條件下取胸主動脈，以貼塊法培養(yǎng)VSMCs，細胞生長融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，以106～107/L的密度傳代培養(yǎng)，對細胞進行形態(tài)學觀察并對細胞內平滑肌肌動蛋白α - actin 進行免疫細胞化學染色，95% 以上的細胞呈陽性著色，證實細胞為VSMCs。取3 ～5 代細胞用于實驗。

2.2 實驗分組 將細胞以5 ×107/L 的密度培養(yǎng)24 h 后吸去孔內液體，加入無血清培養(yǎng)基，24 h 后再次吸去孔內液體，按以下分組加入試劑:(1)對照組:加10%FBS 的DMEM;(2)TGF -β1組:加10%FBS的DMEM 和10 μg/L TGF-β1;(3)縫隙連接阻斷劑組:加含10%FBS 的DMEM 和50 mmol/L 18α-GA。(4)TGF-β1+縫隙連接阻斷劑組:加含10%FBS 的DMEM、10 μg/L TGF-β1和50 mmol/L 18α-GA。

2.3 免疫熒光細胞化學檢測Cx40 和Cx43 在細胞內表達及共定位 按實驗分組制作細胞爬片，用PBS 洗3 遍，4%預冷的多聚甲醛固定20 min 后用含0.2% 非離子型表面活性劑Triton 的PBS 液洗3 遍，0.2%Triton X-100 室溫透膜30 min，含0.2% Triton的PBS 洗3 遍，血清封閉30 min，含0.2% Triton 的PBS 洗3 遍，加入Cx40 (1∶100)和Cx43(1∶50)Ⅰ抗4 ℃濕盒內過夜，含0.2% Triton 的PBS 洗3 遍后，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記Ⅱ抗(1∶50);四甲基異硫氰酸羅丹明(tetraethyrodamine isothiocyanate，TRITC)標記Ⅱ抗(1∶50)，室溫避光孵育2 h，含0.2% Triton 的PBS 沖洗3 次，加核染料4'，6 -二脒基-2 -苯基吲哚(4'，6 -diamidino-2 -phenylindole，DAPI)(1∶1 000)室溫避光孵育15 min，含0.2%Triton 的PBS 洗3 遍，60%緩沖甘油封片，激光共聚焦顯徽鏡下觀察，實驗中設立陰性對照、陽性對照和空白對照。

2.4 MTT 法檢測VSMCs 的增殖活性 制備細胞懸液，用含10%FBS 的DMEM 液稀釋成5 ×107/L，接種于96 孔板，每孔加入200 μL 混勻后的細胞懸液，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，用PBS 液沖洗1 ～2 遍。每孔加入不含F(xiàn)BS的DMEM 液，各200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞同步于G0/G1期。棄去培養(yǎng)液，分別按實驗分組加入試劑，每組8 個復孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，各組棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT 20 μL，孵育4 h，加入二甲基亞砜(dimathyl sulfoxide，DMSO)150 μL，于酶標儀上檢測各孔570 nm 處吸光度(A 值)。

2.5 流式細胞術檢測細胞周期 在6 孔板內各組試劑作用24 h 后吸凈孔內培養(yǎng)基，PBS 沖洗2 次，1 000 r/min 離心8 min，棄上清液加PBS 液吹打均勻，1 000 r/min 離心4 min，重復2 次，棄上清液加PBS 液吹打均勻，然后加入70%乙醇4 ℃過夜，至少18 h，1 000 r/min 離心5 min，加PBS 重懸離心同上，重復2 次后，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液0.5 mL，置于4 ℃，30 min 后上流式細胞儀，重復4次，進行細胞周期檢測，通過特殊軟件計算S 期的百分率，以反映細胞增殖能力。

2.6 Western blotting 法檢測SHR VSMCs 內Cx40、Cx43 蛋白表達 在6 孔板內各組試劑作用24 h 后吸凈孔內培養(yǎng)基，預冷PBS 沖洗3 次，加入細胞裂解液200 μL，吹打，轉入1.5 mL EP 管中，保持冰上30 min 后4 ℃離心，12 000 r/min 離心10 min，取上清用5 ×加樣緩沖液以4∶1 的比例稀釋，煮沸6 ～8 min，BCA 法測蛋白質濃度進行蛋白質定量，-20 ℃保存。所有實驗均獨立重復3 次。以上蛋白樣品(30 μg)經10 %聚丙烯凝膠電泳分離后，恒壓25 V 電轉移50 min 到硝酸纖維素濾膜(NC)上，然后封閉緩沖液(5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白)中封閉1 h。將膜放入用5% 封閉液稀釋的Ⅰ抗(Cx43 稀釋比例為1∶1 000;Cx40 稀釋比例為1 ∶200)中，在室溫下孵育，持續(xù)搖動2 h。1 ×TBST(10mmol/L Tris - HCl，pH 7.4，150 mmol/L 氯化鈉，0.05% Tween -20)洗膜，將膜用封閉緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的第Ⅱ抗體(1∶2 000 稀釋)，室溫作用2 h，1 ×TBST 洗膜，新鮮配制的ECL 顯色液1 mL(A、B液等體積混勻)和膜孵育1 min，封入保鮮膜中，壓片，顯影于感光膠片上。將經以上處理的NC 膜用洗脫緩沖液(strip buffer)室溫孵育1 h 后，洗膜3 次，每次15 min。用β -actin 內參抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，以同樣方法顯影于感光膠片。用Bandleader 3.0 軟件對條帶進行灰度掃描，按下述公式分別計算3 次實驗中樣品蛋白的相對含量:蛋白相對含量(該蛋白條帶的灰度值-背景的灰度值)/(對照條帶的灰度值- 背景的灰度值)，以此比值計算均數(shù)與標準差。

2.7 染料示蹤分子傳遞法(劃痕標記染料傳輸法)

檢測血管平滑肌細胞間縫隙連接功能:在6 孔板內各組試劑作用24 h 后吸凈孔內培養(yǎng)基，以37 ℃預溫的PBS 沖洗細胞3 次，加熒光染料0.05%LY 和0.05%RD 的1∶1 混合液，每孔1 mL，用銳利的外科手術刀在細胞表面上劃痕數(shù)條并計時，孵育3 min 吸出熒光染料，PBS 沖洗細胞3 次，然后加入少量PBS以剛好覆蓋細胞為宜，熒光顯微鏡下觀察，LY 熒光的顯示用FITC 系統(tǒng)的濾光片，RD 用羅丹明系統(tǒng)濾光片，LY 熒光染料傳遞百分數(shù)=LY 熒光陽性細胞數(shù)(劃痕細胞外)/劃痕標記的細胞(即RD+LY 陽性細胞數(shù))，重復實驗3 次，統(tǒng)計分析后，以此代表縫隙連接功能的強弱。其大小代表細胞間縫隙連接通訊功能強弱。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 免疫熒光技術檢測SHR VSMCs 中Cx43 與Cx40 蛋白的表達及兩者的共定位

共聚焦熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光為Cx43 的陽性著色，主要定位于胞漿，紅色熒光為Cx40 的陽性著色，主要定位于胞漿與胞膜，橙色熒光為兩者的重疊熒光，主要定位于胞漿，藍色熒光顯示為細胞核的DNA 染料(DAPI)陽性著色，可見SHR VSMCs 中Cx43 和Cx40 蛋白表達呈陽性，兩者共定位于胞漿，見圖1。

Figure 1. The expression and co-localization of Cx43 and Cx40 proteins in SHR VSMCs(×400).圖1 SHR VSMCs 中Cx43 與Cx40 蛋白的表達及兩者的共定位

2 VSMCs 的增殖

2.1 各實驗組VSMCs 的增殖活性 與對照組相比，TGF-β1組的A 殖增高(P ＜0.05)，VSMCs 增殖活性增加，18α - GA 組的A 值降低(P ＜0.05)，VSMCs 增殖活性減少，TGF -β1+18α -GA 組A 值無明顯差異(P ＞0.05);與TGF -β1組相比，TGF -β1+18α-GA 組A 值明顯降低(P ＜0.05)，VSMCs增殖活性減少，見表1。

2.2 流式細胞儀檢測細胞周期 結果顯示:與對照組相比，TGF - β1組S 期比例增高(P ＜0.05)，VSMCs 增殖能力增加，18α-GA 組S 期比例降低(P＜0.05)，VSMCs 增殖能力減弱，TGF - β1+18α -GA 組S 期比例比無顯著差異(P ＞0.05);與TGF -β1組相比，TGF-β1+18α -GA 組S 期比例明顯降低(均P ＜0.05)VSMCs，增殖能力減弱，見圖2、3。

表1 MTT 法測得各組SHR VSMCs 的A 值Table 1. The A values of SHR VSMCs in different groups detected by MTT(±s.n=10)

表1 MTT 法測得各組SHR VSMCs 的A 值Table 1. The A values of SHR VSMCs in different groups detected by MTT(±s.n=10)

* P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.

Group A 570 Control 0.34 ±0.04 TGF-β1 0.39 ±0.04*18α-GA 0.27 ±0.02＊△TGF-β1 +18α-GA 0.31 ±0.02△

3 Western blotting 法檢測SHR VSMCs 內Cx40和Cx43 蛋白表達

與對照組相比，TGF-β1組Cx43 蛋白表達增強(P ＜0.05)，Cx40 表達無顯著差異(P ＞0.05)，18α-GA 組Cx43 和Cx40 表達均減弱(P ＜0.05)，TGF-β1+18α - GA 組Cx40 和Cx43 表達無顯著差異(P ＞0.05);與TGF -β1組相比，TGF -β1+18α -GA 組Cx43 表達減弱(P ＜0.05)，Cx40 表達無顯著差異(P ＞0.05)，見圖4、5。

4 染料示蹤分子傳遞法檢測血管平滑肌細胞間縫隙連接功能

與對照組相比TGF -β1組，熒光染料傳遞分數(shù)增加，縫隙連接功能明顯增強(P ＜0.05)，18α -GA組熒光染料傳遞分數(shù)降低，縫隙連接功能明顯減弱(P ＜0.05)，TGF-β1+18α-GA 組熒光染料傳遞分數(shù)無明顯差異，縫隙連接功能無顯著差異(P ＞0.05);與TGF-β1組相比，TGF -β1+18α -GA 組熒光染料傳遞分數(shù)降低，縫隙連接功能顯著降低(P＜0.05)，見圖6、7。

Figure 2. The PI atlas of cell cycle of SHR VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF-β1 group;C:18α-GA agent group;D:TGF-β1 + 18α-GA group.圖2 各組細胞細胞周期PI 圖譜

Figure 3. The percentage of S - phase in cell cycle of SHR VSMCs from different groups. ±s.n =4. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.圖3 各組細胞細胞周期S 期所占百分數(shù)

Figure 4. Expression of the Cx43 and Cx40 proteins examined by Western blotting in SHR VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF - β1 group;C:18α - GA agent group;D:TGF - β1 + 18α - GA group.圖4 各組Cx43 和Cx40 蛋白的表達

Figure 5. The expression of Cx43 and Cx40 proteins in VSMCs from different groups. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.圖5 各組Cx43 和Cx40 蛋白的表達

Figure 6. The atlas of gap junction function in VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF-β1 group;C:18α -GA agent group;D:TGF -β1 + 18α -GA group.圖6 檢測各組縫隙連接功能圖

Figure 7. The percentage of fluorescent dye transfer in SHR VSMCs from different groups. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.圖7 各組熒光染料傳遞百分數(shù)

討 論

血管平滑肌舒縮是依賴細胞間的信號物質進行調節(jié)的。平滑肌細胞之間相互調節(jié)作用除了由旁分泌及自分泌介導的間接通訊外，可能還涉及由縫隙連接介導直接通訊的作用［5］。

縫隙連接是由連接相鄰兩個細胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結構。它由細胞膜上的連接子相互銜接而成，每個連接子由6 個Cx 圍成，形成跨膜蛋白通道［6］。不同類型的連接蛋白可以形成不同類型的連接子，構成不同類型的連接通道，不同連接蛋白分子之間組合形成的縫隙連接通道的通透性和導電性有所不同［7］，從而使得縫隙連接在結構組成和功能上表現(xiàn)出多樣性［8］，并對血管平滑肌舒縮等生理過程起著重要的調控作用。而血管平滑肌細胞以Cx43 和Cx40 表達為主。

TGF-β1是一種多功能細胞因子，能調節(jié)細胞增殖、分化，其作用取決于細胞密度、組織來源、TGF-β 濃度，對于血管平滑肌細胞的增殖以及介導高血壓等心血管疾病的發(fā)生起著重要的作用。在我們前期的研究中顯示:與正常血壓大鼠組相比，SHR VSMCs A 值和S 期比例都明顯升高，提示SHR 血管平滑肌細胞本身就處在增殖狀態(tài)，且TGF - β1對SHR VSMCs 增殖活性具有明顯的促進作用，并隨著TGF- β1濃度的升高而逐漸增強［9］，與相關文獻一致。

本實驗中我們分別用TGF-β1和縫隙連接阻斷劑18α-GA 處理SHR VSMCs，發(fā)現(xiàn)TGF -β1進一步促進了細胞的增殖，當縫隙連接阻斷后，完全組斷了TGF-β1對細胞的促增殖效應。本研究結果首次證實，縫隙連接可能參與了TGF - β1誘導的SHR VSMCs 的增殖作用。

為了進一步探討TGF-β1是否通過改變連接蛋白的表達，調節(jié)縫隙連接通道的功能，影響細胞間直接通訊，并導致血管平滑肌細胞增殖，在本研究中我們用激光共聚焦顯微鏡觀察Cx43 和Cx40 蛋白表達及定位，結果顯示兩者共定位于胞漿，并通過Western blotting 各組Cx43 和Cx40 的蛋白表達，結合劃痕標記染料傳輸法檢測了縫隙連接功能的變化，結果發(fā)現(xiàn):TGF-β1處理使SHR 血管平滑肌細胞Cx43 蛋白表達上調，增強了縫隙連接通訊功能。縫隙連接阻斷劑抑制了TGF-β1引發(fā)的Cx43 蛋白表達上調;并降低了縫隙連接功能，因此我們認為TGF -β1主要通過上調SHR 血管平滑肌細胞Cx43 蛋白表達，引起縫隙連接通訊功能增強，從而促進了SHR 血管平滑肌細胞的增殖作用，而Cx40 蛋白表達可能不起主要作用。

此外，縫隙連接功能的調節(jié)受多種因素的影響，如縫隙連接蛋白的表達、縫隙連接蛋白的磷酸化等，在本研究中我們僅就縫隙連接蛋白的表達做了初步研究，而縫隙連接在TGF -β1誘導的正常大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用及其機制有待進一步探討。

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［2］ 鐘 華，何 芳，胡清華，等. ERK 和Smad 通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用［J］. 中國病理生理雜志，2009，25(9):1665 -1670.

［3］ Lee S，Chen TT，Barber CL，et al.Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis［J］. Cell，2007，130(4):691 -703.

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