樊竑冶 趙光鋒 劉 飛 王建軍 侯亞義

(南京大學醫(yī)學院和生物醫(yī)藥技術國家重點實驗室，南京210093)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及全身多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病，它以產(chǎn)生致病性自身抗體及顯著的T和B細胞異常活化為特征。盡管許多免疫異常涉及SLE的發(fā)生發(fā)展和臨床癥狀，但近年來大量的證據(jù)以及最近的B細胞剔除療法的效果都支持，B細胞異常活化和功能改變在SLE的發(fā)病機理中發(fā)揮著關鍵的作用［1］。

IL-1是一種重要的介導炎性反應的炎性細胞因子，它參與調(diào)節(jié)機體的免疫應答、炎癥等過程。在慢性炎癥過程中，IL-1的調(diào)節(jié)障礙、延遲合成和釋放都會導致包括SLE等疾病的發(fā)生。研究報道，在狼瘡模型小鼠中，IL-1β的處理能加速MRL/lpr狼瘡小鼠的發(fā)病及進展;在狼瘡患者中，IL-1α和IL-1β基因的特異多態(tài)性與SLE的發(fā)病高風險率密切相關［2，3］。然而，臨床上關于 SLE 患者 IL-1的報道大多關注外周血其水平高低的變化［4］。

最近有研究報道，只有 IL-1β能直接作用于CD4+T細胞，增強其在抗原作用下的增殖和分化［5］。已有報道，Toll樣受體(TLR)參與多種疾病包括SLE的發(fā)生發(fā)展，且B細胞能表達一些TLR和IL-1受體［6，7］。我們最近對SLE患者外周血B細胞進行基因芯片分析，有趣地發(fā)現(xiàn)SLE患者的B細胞高表達IL-1受體和TLR4［8］。許多研究已證實，IL-1受體和TLR4信號轉(zhuǎn)導有著共同下游途徑，可是，關于IL-1β對B細胞功能的作用機制未見報道。因此，本文從正常小鼠和SLE模型小鼠脾臟純化的B細胞，首次比較分析了IL-1β和TLR4信號在B細胞功能變化中的作用，以便為解釋B細胞參與SLE的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57/B6小鼠以及MRL/lpr狼瘡小鼠，購自南京大學模式動物研究所。

1.1.2 試劑與儀器 PE-anti-CD19，PE/Cy5-anti-CD19，PE-anti-CD40，PE-anti-CD80，PE-anti-CD86，PE-anti-CD69，PE-anti-TLR4 以及 PE-IgG2b isotype control均購自eBioscience公司;脂多糖(LPS)購自Sigma公司;IL-1β購自 Protech公司;小鼠CD19+陽選磁珠購自Miltenyi公司;RPMI1640與胎牛血清培養(yǎng)基購自Gibco公司;qRT-PCR引物合成于Invitrogen公司;流式細胞儀為BD FACScalibur公司產(chǎn)品;實時定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 無菌脾臟單個細胞懸液的制備 脫頸椎處死小鼠，放入75%的酒精10分鐘;在超凈工作臺內(nèi)取小鼠脾臟于無菌PBS中，用鑷子拉碎;1 mg/ml膠原酶D在37℃下消化30分鐘，并在最后10分鐘加入含有終濃度10μmol/L EDTA的PBS;反復吹打消化后的組織塊，200目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去組織和團塊;4℃，1200 r/min離心5分鐘，洗去膠原酶D;加入預冷至4℃的紅細胞裂解液(ACK)，充分混勻振蕩，4℃靜置5分鐘;4℃，1 200 r/min離心5分鐘，去上清;適量無菌PBS重懸。

1.2.2 B細胞的分離純化 700μl磁珠專用 PBS重懸107個脾臟單個細胞，加入100μl CD19+單抗偶聯(lián)的磁珠，混勻，4℃孵育15分鐘;5ml磁珠專用PBS洗一次，4℃，1 200 r/min離心10分鐘，去上清;將上述磁珠和細胞的混合液對倍稀釋后，使用磁珠分離柱(LS)對細胞進行陽選，得到磁珠標記陽性的細胞群，即純化的小鼠脾臟B細胞。適量PBS重懸，用小鼠CD19-PE單克隆抗體標記純化后的B細胞，流式細胞儀檢測B細胞純度。

1.2.3 細胞增殖活力檢測(CCK-8法) 將各組細胞懸液濃度調(diào)整為5×105個/ml，每孔200μl均勻接種于96孔板中，每組細胞設6個重復孔;分別用10、100及 200 ng/ml IL-1β處理 B細胞，于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后，每孔加入CCK-8試劑20μl，37℃、CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育6小時;Bio-Tek酶標儀檢測450 nm處的光吸收值。

1.2.4 流式細胞術檢測B細胞表面分子 各組細胞轉(zhuǎn)移到標準BD流式管中，每管5×105個細胞，每組設三個重復管;流式專用PBS洗細胞一遍，4℃，1 200 r/min離心5分鐘，去上清;加入80μl流式專用 PBS和10 μl相應熒光抗體(CD40、CD80、CD86、CD69、TLR4)，4℃，孵育 30 分鐘(各熒光抗體濃度參見抗體說明書);流式專用PBS洗3次，4℃，1 200 r/min離心5分鐘;200μl PBS重懸，上流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.5 實時定量熒光PCR儀檢測B細胞中基因的表達 收集100 ng/ml IL-1β處理的 B細胞，總RNA抽提按Trizol試劑 (Invitrogen公司)說明書進行。以GAPDH作為內(nèi)參照，進行實時定量PCR，反應條件參照 FastStart Universal SYBR Green Master RealTime PCR Quantitation Kit提供的說明書操作。IL-6以及IL-10的相對表達水平用2-△Ct計算。

2 結(jié)果

2.1 磁珠分選后B細胞的純度 CD19是小鼠B細胞特異性的表面標志，表達于前B細胞和成熟B細胞。我們采用PE-CD19熒光單克隆抗體標記磁珠分選前后的細胞，流式細胞術鑒定分選后的B細胞純度達到95.55%(圖1)，符合后續(xù)實驗的需要。

圖1 磁珠分選前后B細胞純度的檢測Fig.1 The purity of B cells

2.2 IL-1β對正常小鼠脾臟B細胞及SLE小鼠脾臟B細胞增殖的影響 純化后的B細胞分別經(jīng)過10、100及200 ng/ml IL-1β處理72小時后，采用CCK-8試劑檢測各組細胞活力。CCK-8被細胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的橙色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細胞數(shù)量成正比。結(jié)果表明，IL-1β不影響正常小鼠B細胞以及SLE小鼠B細胞的增殖(圖2)。

2.3 IL-1β對正常小鼠和SLE小鼠共刺激分子表達的影響 為了確定IL-1β是否能夠促進B細胞的活化，我們采用流式細胞術檢測了B表面共刺激分子CD80、CD86和CD40的表達。結(jié)果表明，IL-1β處理B細胞24小時后，正常小鼠以及SLE小鼠B細胞表面CD80和CD86的表達無顯著變化，CD40表達在SLE小鼠B細胞中顯著上調(diào)(圖3)。

圖2 IL-1β對正常小鼠和SLE小鼠B細胞增殖的影響Fig.2 The effect of IL-1β on proliferation of normal and SLE mouse B cells

圖3 IL-1β對正常小鼠和SLE小鼠B細胞共刺激分子表達的影響Fig.3 The effect of IL-1β on costimulatory molecule expression in normal and SLE mouse B cells

圖4 IL-1β對正常小鼠和SLE小鼠B細胞活性和細胞因子表達的影響Fig.4 The effect of IL-1β on activation and cytokine expression of normal and SLE mouse B cells

圖5 IL-1β與LPS協(xié)同能增強SLE小鼠B細胞CD40和CD69表達的影響Fig.5 IL-1β and LPS synergistically strengthen the expression of CD40 and CD69 in SLE mouse B cells

2.4 IL-1β對B細胞活化及細胞因子表達的影響

為了進一步研究IL-1β對B細胞活化以及細胞因子表達的影響，我們首先利用流式細胞術檢測了各組B細胞表面活化分子CD69的表達。結(jié)果表明，100 ng/ml IL-1β能夠顯著上調(diào)SLE小鼠B細胞CD69表達(圖4)。同時，我們用實時定量PCR儀檢測細胞因子IL-6及IL-10的表達，結(jié)果顯示IL-1β顯著上調(diào)SLE小鼠B細胞中IL-6及IL-10的表達，但對正常小鼠B細胞無顯著影響(圖4)。

2.5 IL-1β與 LPS協(xié)同能增強 SLE小鼠 B細胞CD40和CD69表達的影響 LPS能夠加速SLE小鼠的發(fā)病進程，我們在用 IL-1β與 LPS聯(lián)合刺激SLE小鼠B細胞發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠協(xié)同增強B細胞CD40和CD69的表達(圖5A)，而對正常小鼠B細胞沒有協(xié)同作用(圖5B)。

2.6 IL-1β對SLE小鼠B細胞TLR4表達的影響

IL-1β與LPS協(xié)同增強B細胞的活化可能與SLE小鼠B細胞異常表達TLR4有關。為了證明我們的假設，我們用100 ng/ml的IL-1β處理正常小鼠和SLE小鼠B細胞。24小時后，收集細胞流式檢測B細胞TLR4的表達情況。結(jié)果表明，IL-1β促進SLE小鼠B細胞中TLR4的表達，而對正常小鼠B細胞沒有影響(圖6)。

圖6 IL-1β對正常小鼠和SLE小鼠B細胞TLR4表達的影響Fig.6 The effect of IL-1β on TLR4 expression of normal and SLE mouse B cells

3 討論

IL-lβ是一種重要的炎性細胞因子，參與SLE的發(fā)病。B細胞不僅是免疫系統(tǒng)中的抗體產(chǎn)生細胞，而且也是重要的抗原提呈細胞。受到刺激時，抗原提呈細胞包括B細胞能夠表達多種共刺激分子，如CD80、CD86及CD40等。我們獲得的B細胞純度高達95%，說明實驗結(jié)果幾乎不受其它細胞的影響。我們用IL-lβ刺激B細胞后，發(fā)現(xiàn)IL-lβ不影響B(tài)細胞的增殖，也不影響其表達CD80和CD86，但IL-lβ能刺激SLE小鼠的B細胞高表達CD40。已知，CD40是與T細胞和B細胞功能有關的一種表面抗原，抗IgM抗體、抗CD20抗體以及IFN-γ均可刺激B細胞表達CD40，提示IL-lβ具有刺激SLE小鼠B細胞活化的作用。

我們還發(fā)現(xiàn)，IL-lβ能刺激SLE小鼠的B細胞高表達CD69、IL-6及 IL-10。許多研究表明，CD69的表達是淋巴細胞增殖前的一個早期激活標志。有研究認為，SLE是一種以細胞因子網(wǎng)絡為特征的自身免疫病。B細胞信號和調(diào)節(jié)異常對過量的抗體產(chǎn)生負有重要的責任。炎癥細胞因子IL-1和IL-6以及免疫調(diào)節(jié)的細胞因子IL-10已被證實是SLE的重要參與者。IL-6和IL-10被證明是炎癥加重和B細胞活性調(diào)節(jié)的關鍵因素［9，10］。許多類型的細胞包括B細胞可產(chǎn)生IL-6，IL-6能誘導B細胞分化為漿細胞和IgG產(chǎn)生。狼瘡模型小鼠表明IL-6參與B細胞的過度活化和自身免疫性疾病的發(fā)病。在MRL/lpr小鼠中，血清IL-6的水平隨著年齡增加而增加，而IL-6缺陷的MRL/lpr小鼠表現(xiàn)發(fā)病延遲［4］。還有研究發(fā)現(xiàn)，老年人比年輕人的活化B細胞能產(chǎn)生更多的IL-6和IL-10，提示失調(diào)的細胞因子可能反映免疫功能的老化［11］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，瘦素能劑量依賴地激活人的外周血B細胞誘導產(chǎn)生IL-6和IL-10，這些細胞因子的產(chǎn)生是通過 JAK2/STAT3和p38MAPK/ERK1/2信號途徑的激活實現(xiàn)的，而且這些信號途徑可能促進B細胞的炎癥性和免疫調(diào)節(jié)特性［12］。我國學者還探索了不同體外刺激對小鼠腹膜腔B細胞產(chǎn)生IL-10的影響，發(fā)現(xiàn)不同的刺激、刺激強度及刺激時間影響B(tài)淋巴細胞產(chǎn)生IL-10［13］。我們的結(jié)果進一步確證，IL-lβ 具有刺激SLE小鼠的B淋巴細胞活化的功能。

有研究證實，細菌的脂多糖(LPS)能加速和加劇SLE模型小鼠的狼瘡性腎炎及誘導炎癥細胞浸潤腎臟［14］。我國學者發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激后，樹突狀細胞(DC)細胞表面分子水平隨刺激時間延長有不同的上升趨勢，提示LPS介導的DC成熟過程中的表型分子有不同的變化趨勢［15］。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，IL-1β能增強LPS刺激狼瘡小鼠的B細胞的功能異常，大量表達CD40和CD69。

TLR4介導LPS誘導的免疫應答，進而啟動細胞因子和趨化因子基因的轉(zhuǎn)錄，或?qū)е卵仔砸蜃拥漠a(chǎn)生，提示TLR4介導的信號通路參與了多種炎癥疾病的發(fā)生與發(fā)展。小鼠TLR4的過度表達能導致自身免疫性的腎小球性腎炎和狼瘡樣疾病，提示LPS介導的TLR4信號在狼瘡腎炎的發(fā)病起著極其重要的作用［16］。進一步，由TLR4信號激活的B細胞能產(chǎn)生更多的細胞因子包括IL-10［17］。TLR4屬于I型跨膜蛋白，主要行使識別配體以及與其他輔受體結(jié)合形成受體復合物;胞質(zhì)區(qū)含有Toll-IL-1受體結(jié)構域(TIR結(jié)構域)［18］，IL-1受體和TLR4信號轉(zhuǎn)導有著共同下游途徑。因此，我們懷疑，IL-1β可能增強SLE小鼠的B細胞高表達TLR4。我們的實驗結(jié)果顯示，IL-1β確實能提高SLE小鼠B細胞的TLR4表達。

綜上所述，IL-lβ能刺激B細胞高表達CD40;IL-lβ也能刺激B細胞高表達CD69、IL-6及IL-10;IL-1β還能增強LPS刺激SLE小鼠的B細胞大量表達CD40和CD69;進一步，IL-1β確實能提高SLE小鼠的B細胞高表達TLR4。這些結(jié)果說明IL-1β可能通過誘導TLR4表達來可增強LPS刺激引起的SLE小鼠的B細胞功能異常，提示控制感染和抑制炎癥可能達到減緩SLE病程的目的。

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