曹 妍 王大南 孫 玥 梅原久範(fàn) 呂昌龍

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001)

Fas(CD95/APO-1)與Fas配體或者抗Fas抗體(CH11)結(jié)合，在胞漿形成死亡受體誘導(dǎo)的信號(hào)復(fù)合體(DISC)，可進(jìn)一步活化caspase分子，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SN38(10-hydroxy-7-ethyl-camptothecin)可通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoisomeraseⅠ，TopoⅠ)選擇性殺傷S期細(xì)胞，具有廣泛的抗腫瘤譜［1，2］。

脂筏是細(xì)胞膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域(Microdomain)。鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)是脂筏的重要組成成分。一些研究表明，F(xiàn)as可以易位和聚集于脂筏所在區(qū)域［3，4］，脂筏通過(guò)促進(jìn)DISC的形成進(jìn)而活化caspase依賴的細(xì)胞死亡途徑［5］。本研究的前期結(jié)果顯示，SN38能夠加強(qiáng)WR/FASSMS1細(xì)胞Fas介導(dǎo)的凋亡現(xiàn)象，但對(duì)WR/Fas-SM(-)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用不明顯［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)擬探討在SN38和CH11的共同作用下，細(xì)胞內(nèi)部到底有哪些DNA損傷的信號(hào)分子和caspase分子參與了這一過(guò)程?并且分析它們的活化強(qiáng)度和作用特點(diǎn)，進(jìn)而明確該過(guò)程中脂筏的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 WR/Fas-SMS1細(xì)胞和WR/Fas-SM(-)細(xì)胞由日本金沢醫(yī)科大學(xué)血液免疫內(nèi)科提供［7］。

1.2 主要試劑及儀器 0.4%臺(tái)盼藍(lán)(Gibco);RPMI1640培養(yǎng)液 500 ml(Gibco，Invitrogen);CH11(Medical＆Biological Laboratories， Japan);SN38(Yakult pharmaceutical，Japan);抗 phospho-ATM(Ser1981)、phospho-Chk1(Ser345)、phospho-p53(Ser15)、cleaved caspase-3(Asp175)、cleaved caspase-8(Asp391)和 α/βTubulin抗體購(gòu)自 Cell Signaling Technologies Japan(Tokyo，Japan);抗phospho-p21、p21和 ATM抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology，Inc(Santa Cruz，CA，USA);抗 β-actin抗體購(gòu)自Rockland Immunochemicals，Inc(Gilbertsville，PA，USA)。電泳裝置、轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) WR/FAS-SM(-)細(xì)胞和WR/FASSMS1細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞處理 常規(guī)收集并且計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105ml-1，接種24孔板，每孔1 ml。CO2細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)2小時(shí)后，分別加入不同濃度SN38和/或CH11刺激，混勻細(xì)胞后，放入CO2細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 蛋白樣品處理 收集5×105個(gè)細(xì)胞，離心，1 200 r/min，3分鐘，離心后棄上清。每管中加50 μl現(xiàn)配 lysing buffer，Vortex 5～10秒，劇烈震蕩，置于冰上30分鐘。每10分鐘震蕩一次。4℃離心，10 000 r/min，10分鐘。取上清與等體積的sample buffer混合，煮沸6分鐘。常溫離心，10 000 r/min，10分鐘。上清即為電泳的蛋白樣品。

1.6 Western blot 取處理后的蛋白樣品15μl于每個(gè)泳道中，同時(shí)設(shè)一個(gè)泳道加入6μl Rainbow marker，經(jīng)6% ～15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含有5%脫脂奶粉的TBS溶液封閉2小時(shí)，經(jīng)TBST液洗膜5分鐘×3次后，再用TBS液洗膜5分鐘×1次。加入100倍稀釋的一抗，4℃過(guò)夜孵育。棄去一抗，TBST液洗膜5分鐘×3次，TBS液洗膜5分鐘×1次后，加入1 000倍稀釋的二抗，室溫孵育30分鐘。棄去二抗，再次TBST液洗膜5分鐘×3次，TBS液洗膜5分鐘×1次后，加入ECL發(fā)光液，染色1分鐘后，于暗室曝光顯像。

1.7 結(jié)果分析 應(yīng)用QUANTISCAN DEMO軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度分析，結(jié)果以目的條帶密度與內(nèi)參條帶密度的比值形式表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 SN38和CH11共同作用對(duì)WR/FAS-SM(-)細(xì)胞和WR/FAS-SMS1細(xì)胞ATM活化水平的影響磷酸化ATM的表達(dá)水平在WR/FAS-SMS1細(xì)胞被SN38和CH11共同作用后的0.5和1小時(shí)升高，而在WR/FAS-SM(-)細(xì)胞中，沒(méi)有見(jiàn)到磷酸化ATM表達(dá)水平的升高?？侫TM的表達(dá)水平在兩種細(xì)胞中均未見(jiàn)明顯升高，見(jiàn)圖1。

2.2 SN38和CH11共同作用對(duì)WR/FAS-SM(-)細(xì)胞和WR/FAS-SMS1細(xì)胞Chk1活化水平的影響磷酸化Chk1在WR/FAS-SMS1細(xì)胞和WR/FAS-SM(-)細(xì)胞中的表達(dá)均呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系，在1小時(shí)和3小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，Chk1的活化狀態(tài)在兩細(xì)胞之間存在顯著性差異，并且 Chk1的活化由 SN38而非CH11誘導(dǎo)，見(jiàn)圖2～4。

圖1 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后ATM的活化水平Fig.1 ATM activation during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FAS-SMS1

圖2 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后Chk1的活化水平Fig.2 Chk1 activation during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FAS-SMS1

圖3 SN38和/或 CH11作用 WR/FAS-SM(-)和 WR/FAS-SMS1后Chk1的活化水平Fig.3 Chk1 activation during SN38 and/or CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FAS-SMS1

圖4 不同濃度CH11作用WR/FAS-SM(-)和WR/FASSMS1后Chk1的活化水平Fig.4 Chk1 activation during CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FAS-SMS1

圖5 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后p53的活化水平Fig.5 p53 activation during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)cells and WR/FAS-SMS1

圖6 SN38和/或 CH11作用 WR/FAS-SM(-)和 WR/FAS-SMS1后p53的活化水平Fig.6 p53 activation during SN38 and/or CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)cells and WR/FAS-SMS1

圖7 不同濃度CH11作用WR/FAS-SM(-)和WR/FASSMS1后p53的活化水平Fig.7 p53 activation during CH11 treatment of WR/FASSM(-)and WR/FAS-SMS1

2.3 SN38和CH11共同作用對(duì)WR/FAS-SM(-)細(xì)胞和WR/FAS-SMS1細(xì)胞p53活化水平的觀察 磷酸化p53在WR/FAS-SMS1細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系，在14小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，磷酸化p53的表達(dá)水平在兩細(xì)胞之間存在顯著差異;CH11和SN38的共同作用雖使WR/FAS-SM(-)細(xì)胞p53活化，但無(wú)時(shí)間依賴關(guān)系，并且p53的活化由SN38而非CH11誘導(dǎo)，見(jiàn)圖5～7。

2.4 SN38和CH11共同作用對(duì)WR/FAS-SM(-)細(xì)胞和WR/FAS-SMS1細(xì)胞p21活化水平的觀察 磷酸化p21的表達(dá)水平在 WR/FAS-SMS1細(xì)胞被SN38和CH11共同作用后隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減弱，但是在WR/FAS-SM(-)細(xì)胞中則沒(méi)有表現(xiàn)出這種減弱的趨勢(shì)。當(dāng)SN38單獨(dú)作用于WR/FAS-SM(-)細(xì)胞和WR/FAS-SMS1細(xì)胞時(shí)，磷酸化p21的表達(dá)水平未見(jiàn)相似差異，見(jiàn)圖8、9。

圖8 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后p21的活化水平Fig.8 p21 activation during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)cells and WR/FAS-SMS1

圖9 SN38單獨(dú)作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后p21的活化水平Fig.9 p21 activation during SN38 treatment of WR/FASSM(-)and WR/FAS-SMS1

圖10 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后caspase-3的活化水平Fig.10 Activation of caspase-3 during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FASSMS1

圖11 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后caspase-8的活化水平Fig.11 Activation of caspase-8 during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FASSMS1

2.5 SN38和CH11共同作用對(duì)WR/FAS-SM(-)細(xì)胞和WR/FAS-SMS1細(xì)胞caspase-3活化水平的觀察 caspase-3的活化水平在WR/FAS-SMS1細(xì)胞被SN38和CH11共同作用后的3小時(shí)升高，而在WR/FAS-SM(-)細(xì)胞中，沒(méi)有見(jiàn)到cleaved caspase-3表達(dá)水平的升高，見(jiàn)圖10。

2.6 SN38和CH11共同作用對(duì)WR/FAS-SM(-)細(xì)胞和WR/FAS-SMS1細(xì)胞caspase-8活化水平的觀察 經(jīng)過(guò)SN38和CH11的共同作用，cleaved caspase-8的表達(dá)水平在 WR/FAS-SMS1細(xì)胞和WR/FAS-SM(-)細(xì)胞中都有所升高，并且在共同作用0.5、1、3小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上，兩細(xì)胞 cleaved caspase-8的表達(dá)水平存在顯著性差異，見(jiàn)圖11。

3 討論

DNA損傷阻滯包括四類因子，分別為感受因子、傳導(dǎo)因子、調(diào)節(jié)因子和效應(yīng)因子。毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變蛋白(Ataxia telangiectasia mutated，ATM)是感受細(xì)胞DNA損傷的感受因子之一［8-10］，能夠感受雙鏈DNA片段以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，使細(xì)胞周期阻滯在G1、S、G2期［11］。ATM活化后可以活化其下游的一些分子，如p53、Chk以及Brca1和 SMC1等。Chk1是一種絲氨酸/蘇氨酸相關(guān)蛋白，可以在短期內(nèi)減慢DNA合成的速度，阻滯細(xì)胞的分裂。抑癌基因p53及其下游的效應(yīng)分子p21也參與Chk1介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯過(guò)程。一些研究結(jié)果表明Chk1可被伊立替康誘導(dǎo)活化，導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯［12，13］。Wang 和 Takeba［14，15］分別報(bào)道了伊立替康能使p53轉(zhuǎn)錄活性增加和SN38能夠增高Huh7細(xì)胞中p53分子的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)中，Chk1和p53活化水平的檢測(cè)結(jié)果與上述報(bào)道相似。WR/FAS-SMS1細(xì)胞p53的活化強(qiáng)度高于WR/FAS-SM(-)細(xì)胞，而前期的研究結(jié)果也顯示W(wǎng)R/FAS-SMS1細(xì)胞的凋亡率明顯高于WR/FAS-SM(-)細(xì)胞?；诖私Y(jié)果我們推測(cè)，在CH11和SN38的共同作用下，p53的活化誘導(dǎo)了更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡。p21是p53下游的一個(gè)重要靶點(diǎn)，而這只是反映了兩者活化順序的先后。p53能夠在轉(zhuǎn)錄水平活化p21，使細(xì)胞暫時(shí)停滯在G1和G2期，終止DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，給細(xì)胞以充分的時(shí)間進(jìn)行修復(fù)［16］。目前研究表明p53的活化既能促進(jìn)p21的活化，也能抑制p21的活化［17］，本研究結(jié)果則證實(shí)了后者。本研究結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用SN38和CH11與單獨(dú)應(yīng)用SN38相比，WR/FAS-SMS1細(xì)胞的凋亡是由p21磷酸化減弱引起的，正是由于p21沒(méi)有得到有效的活化才使細(xì)胞周期不能發(fā)生停滯，而使細(xì)胞沒(méi)有時(shí)間進(jìn)行修復(fù)從而進(jìn)入凋亡程序。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)提示，在腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性中，p21可能是一個(gè)重要的影響因素，抑制p21的活化將可能成為腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，脂筏可能通過(guò)調(diào)控p21的不同活化狀態(tài)最終導(dǎo)致了兩種細(xì)胞間凋亡率的差異。

caspase-8的活化是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一步，其活化后可以活化下游的 caspase-3，6，7。caspase-3位于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是介導(dǎo)凋亡的重要效應(yīng)分子。本研究中 WR/FAS-SMS1細(xì)胞caspase-8和caspase-3的活化水平強(qiáng)于WR/FAS-SM(-)細(xì)胞，說(shuō)明WR/FAS-SMS1細(xì)胞發(fā)生了更強(qiáng)的凋亡過(guò)程。這正是由于其DNA受損后活化了ATMChk1-p53途徑，但卻抑制了p21的活化，從而細(xì)胞周期沒(méi)有阻滯，使細(xì)胞進(jìn)入了凋亡程序，才啟動(dòng)了caspase-8和caspase-3的活化。有研究報(bào)道，脂筏對(duì)于配受體介導(dǎo)的信號(hào)功能非常重要，它參與TCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡［18，19］。鞘磷脂是細(xì)胞膜上脂筏重要的組成成分，前期研究已經(jīng)表明，鞘磷脂能夠增加DISC形成，介導(dǎo)更強(qiáng)的凋亡［5］。本實(shí)驗(yàn)中的兩株細(xì)胞正是由于膜表面鞘磷脂的差異才產(chǎn)生了不同的凋亡結(jié)果和caspase-8、caspase-3的活化狀態(tài)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，caspase-8活化能引起鞘磷脂酶活化［20］，由此推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中caspase-8的活化也可能作用于WR/FAS-SMS1細(xì)胞鞘磷脂酶，從而使細(xì)胞表面的鞘磷脂合成增加，進(jìn)而放大脂筏促進(jìn)凋亡的過(guò)程，形成一個(gè)正反饋環(huán)路。

綜上，SN38和CH11共同作用 WR/FAS-SMS1細(xì)胞，誘導(dǎo)更強(qiáng)凋亡可能由于活化了細(xì)胞內(nèi)ATMChk1-p53途徑，導(dǎo)致p21活化水平降低，從而活化了caspase-3，8。而作用于WR/FAS-SM(-)細(xì)胞時(shí)，相比單獨(dú)應(yīng)用SN38或者CH11，沒(méi)有引起更明顯的凋亡，則由于Chk1-p53途徑的活化沒(méi)有降低p21活化水平，從而沒(méi)有誘導(dǎo)caspase-3，8分子明顯活化。同時(shí)也提示我們抑制p21的活化將可能成為腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

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