錢 江 陳旺盛 文坤明 傅仲學 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普通外科，重慶400016)

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)排第三位的惡性腫瘤，其死亡率占第四位［1］。目前雖然手術，放化療等傳統(tǒng)治療方式取得了長足的進步和發(fā)展，但仍有大量惡性腫瘤患者死于腫瘤復發(fā)或轉移，因此，尋找一種嶄新的有效的治療方法和途徑，提高患者生存質量有著重要的意義。鋅指轉錄因子Slug作為E-鈣粘蛋白的轉錄抑制因子，在許多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移中起重要作用。Yang等［2］研究發(fā)現(xiàn)Slug基因在惡性腫瘤中過度表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預后有關。本實驗通過構建Slug基因shRNA慢病毒表達載體，轉染人結直腸癌HCT116細胞，觀察其在體外對細胞增殖活性和細胞凋亡周期的影響，為結直腸癌基因靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 人結腸癌細胞株HCT116購自中科院上海細胞研究所;慢病毒載體系統(tǒng)pGCSILGFP Vector、pHelper1.0、pHelper2.0、大腸埃希菌菌株DH5、polybrene購自上海吉凱基因化學技術有限公司;Taq DNA聚合酶、Pyrobest?DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa);MTT試劑盒、蛋白裂解液和電化學發(fā)光(Electrochemilum-inescence，ECL)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;膜連蛋白 V-異硫氰酸熒光素(Annexin VFITC)細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司;RPMI1640和高糖DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清為PAA原裝進口;胰蛋白酶購自Gibco公司;LipofectaminTM2000和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF購自上海申能博彩生物科技有限公司;BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;GAPDH、GFP抗體和HRP標記的鼠二抗均購自Santa Cruz公司;增強型化學發(fā)光檢測試劑盒購自Pierce公司;SYBR Real-time PCR試劑盒購自大連寶生物公司;Slug抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 將人結腸癌HCT116細胞以1×106個/孔接種于6孔板，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于CO2體積分數(shù)為5%的37℃培養(yǎng)箱中。當細胞培養(yǎng)至50% ～70%融合度時，參考Translipid說明書，用脂質體Translipid分別轉染各種siRNA(50 nmol/L)。實驗分組為:空白對照(non interference)組，陰性siRNA(negative siRNA)組和Slug siRNA干擾組。

1.2.2 Real-time PCR檢測Slug基因mRNA的表達 細胞分為空白對照(non interference)組，陰性siRNA(negative siRNA)組和Slug siRNA三組。Trizol抽提細胞RNA，采用Oligo(dT)引物和隨機引物進行逆轉錄，以各組細胞cDNA作為模板，每個組設立三個復孔進行Real-time定量PCR檢測。GAPDH上游引物為:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物為:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3';Slug基因上游引物為:5'-CAAGGACACATTAGAACTCACAC-3'，下游引物為:5'-CTACACAGCAGCCAGATTC-3'。PCR的反應條件:95℃ 2分鐘;95℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒 (40個循環(huán))，反應完成后，得出Ct值，然后計算出相應Ct值，分析各組之間Slug基因的mRNA表達水平的差異。

1.2.3 Western blot法檢測 HCT116 結腸癌細胞中Slug的表達 細胞分為空白對照(non interference)組，陰性siRNA(negative siRNA)組和Slug siRNA三組。收集轉染后的三組細胞濃度為1×107cells/ml，加入裂解液進行蛋白的抽提，BCA法行蛋白的定量。每個樣品抽取20μg進行凝膠電泳，經(jīng)轉膜、封閉一抗 (1∶100)稀釋后，4℃過夜孵育(內(nèi)參GAPDH抗體)，洗膜后用二抗(1∶500)在室溫下雜交1小時，洗膜，ECL發(fā)光，顯影定影。

1.2.4 MTT法測定HCT116細胞增殖活性 胰酶消化對數(shù)生長期細胞，制備濃度為5×104cells/ml單細胞懸液，96孔板中每孔接種100μl，基因沉默方法同前，測定轉染后1、2、3、4、5、6 和 7 天細胞增殖活性。在距離時間點結束4小時時小心吸去上清，加入80μl無血清opti-MEM培養(yǎng)液，再加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后吸掉上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解，混勻后以酶標儀490nm處讀取各孔吸光度值(A490)，每組設定3個復孔，按下面公式計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率(%)=［1-(實驗組A490均值/對照組A490均值)］×100%，以時間為橫坐標軸，吸光度值為縱坐標軸進行繪圖。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞周期 胰酶消化慢病毒轉染后處于對數(shù)生長期細胞，使細胞完全分散變?yōu)閱蝹€細胞，用預冷的PBS液洗滌3次，1 500 r/min離心10分鐘后收集細胞，棄上清，加入1 ml預冷PBS液重懸細胞，加入 PI(1∶100)及 RNase(1∶100)避光冰浴10分鐘，流式細胞儀檢測細胞周期，具體操作按照流式細胞周期分析試劑盒產(chǎn)品說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學分析 各項數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析處理，實驗數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，以±s表示，組間比較采用方差檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 shRNA慢病毒感染HCT116細胞株的轉染效率 慢病毒(Slug-pGC-GFP)當MOI值為1時，感染人結腸癌HCT116細胞，于感染至3天后在熒光顯微鏡下觀察到細胞綠色熒光表達強度高，細胞生長狀態(tài)良好，表明shRNA慢病毒已穩(wěn)定感染，其感染效率約為90%(圖1)。

2.2 Real-time PCR檢測Slug基因的表達 病毒感染HCT116結腸癌細胞后，通過Real-time PCR檢測可見轉染組Slug基因表達明顯低于空白對照組和陰性對照組細胞中Slug基因的表達水平，有明顯的抑制作用(P ＜0.05，圖2)。

2.3 Western blot檢測Slug基因在HCT116結腸癌細胞中的表達 pGCSIL-GFP-shSlug慢病毒對Slug蛋白表達的變化，與空載體組對照相比，轉染組Slug蛋白的表達量顯著降低。見圖3。

2.4 MTT法檢測HCT116細胞增殖 HCT116細胞增殖能力在轉染pGCSIL-GFP-shSlug沉默Slug基因后明顯降低，且干擾組細胞增殖生長速度較另外兩組細胞緩慢，在第4、5、6和7天，顯著差異(n=3，P＜0.05)，而陰性對照組與空白組間吸光度值無顯著差異(n=3，P＞0.05)。實驗結果表明，轉染pGCSIL-GFP-shSlug慢病毒載體后，對結腸癌細胞HCT116的生長具有明顯抑制作用(圖4)。

圖1 HCT116細胞于慢病毒感染后在熒光顯微鏡下發(fā)出的綠色熒光(×100)Fig.1 HCT116 cells emitted green fluorescence under the fluorescence microscope after virus infection(×100)

圖2 Slug基因沉默在結腸癌HCT116細胞Slug mRNA表達Fig.2 Expression of Slug mRNA in HCT116 cells after Slug gene RNAi

圖3 Slug基因沉默在結腸癌HCT116細胞Slug蛋白表達Fig.3 Expression of Slug protein in HCT116 cells after Slug gene RNAi

2.5 流式細胞術檢測細胞周期 HCT116細胞周期在Slug基因沉默后發(fā)生變化，Slug干擾組G0/G1期細胞百分比(52.3 ±0.6)與對照組(45.1 ±0.3)相比，明顯增加(P＜0.05)，S期細胞百分比(16.6±0.5)和對照組(23.2 ±0.6)比較，有所減少，G2/M期細胞百分比(27.1±0.4)低于對照組(32.6±0.7)。上述結果表明:沉默Slug基因能夠將細胞阻滯于G0/G1期，細胞分裂明顯減緩(表1、圖5)。

表1 三組結腸癌HCT116細胞周期各期百分率比較Tab.1 Comparison of the percentages of HCT116 cells at different phases of cell cycle between three groups

圖4 MTT法檢測Slug基因抑制后HCT116細胞增殖Fig.4 The proliferation of HCT116 cells after Slug silence detected with MTT

圖5 流式細胞儀檢測細胞周期Fig.5 The cell detected with flow cytometry

3 討論

RNA干擾技術(RNA interference，RNAi)能抑制腫瘤細胞中某些癌基因的表達，同時也能抑制腫瘤的增殖和轉移，從而達到預防和治療腫瘤的目的。在構建慢病毒RNAi表達載體過程中，轉錄發(fā)卡樣RNA主要是由慢病毒載體骨架和shRNA表達框構成。慢病毒感染宿主細胞后，使shRNA表達框在細胞內(nèi)被RNA酶整合、轉錄后誘導合成RNA干擾，培養(yǎng)持續(xù)表達shRNA的穩(wěn)定細胞株，就可以執(zhí)行RNA干擾作用。

上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)參與了胚胎發(fā)育和正常生理作用，參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并且還與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移密切相關［3］。EMT最重要的標志性變化指標為上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)的減少或丟失，而E-鈣粘蛋白作為細胞間重要的粘附分子，具有抑制腫瘤侵襲轉移的作用［4］，Thiery 等［5］在對E-鈣粘蛋白表達調(diào)控及細胞信號通路的研究中發(fā)現(xiàn)，鋅指轉錄因子Snail在轉錄水平對E-鈣粘蛋白的調(diào)節(jié)為EMT的中心環(huán)節(jié)。鋅指轉錄因子Slug作為Snail基因超家族中的一員，最早發(fā)現(xiàn)于原腸形成和神經(jīng)脊形成過程中的中胚層細胞。在EMT過程中是一個非常重要的調(diào)節(jié)因子。相關研究發(fā)現(xiàn)，Slug基因作為E-cadherin的一個強有力的抑制因子，參與并調(diào)控胚胎發(fā)育、創(chuàng)口愈合、腫瘤發(fā)生與轉移、組織纖維化等生物學過程。Slug基因有高度保守的C2H2-型鋅指結構域，可以通過與E-box結構域結合從而抑制靶基因的轉錄，Slug基因作為Snail家族成員之一，能下調(diào)E-鈣粘蛋白，從而誘導發(fā)生EMT［6，7］。許多實驗研究表明，Slug 基因過度表達在胃癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中起著重要作用［8-11］。為了證實Slug基因在結腸癌細胞中增殖能力和細胞凋亡周期中的作用，本研究在結腸癌HCT116細胞應用RNA干擾技術，下調(diào)Slug基因的表達，shRNA慢病毒載體轉染后，結腸癌HCT116細胞中Slug mRNA和蛋白表達量明顯減少，本實驗表明，干擾Slug基因轉錄水平和蛋白表達后可明顯抑制結腸癌細胞的增殖。Slug基因沉默后，HCT116細胞在G0/G1期出現(xiàn)阻滯，提示沉默Slug基因后可以抑制細胞分裂，Slug基因可能是引起細胞周期改變，從而在結腸癌的惡性增殖中起著重要作用。

本實驗研究結果證實了采用RNA干擾技術可有效地下調(diào)與惡性腫瘤密切相關基因的表達，初步探討了以Slug基因為靶點在結直腸癌基因治療方面的可行性，并為下一步的動物實驗打下基礎。

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