賈慧峰 陸 楠 張 建 (山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥理與免疫治療學(xué)研究所，濟(jì)南250012)

HMBOX1(Homeobox containing 1)基因是近幾年新發(fā)現(xiàn)的基因，于2006年從人胰腺的cDNA文庫(kù)中分離出來，廣泛表達(dá)于人體至少18種的組織器官中，在胰腺、大腦、胎盤等組織中高表達(dá)［1，2］。研究認(rèn)為HMBOX1可能是一種潛在的新型轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。目前關(guān)于該基因的研究還很少，主要集中于HMBOX1在NK細(xì)胞中所發(fā)揮的調(diào)控功能。研究發(fā)現(xiàn)，HMBOX1可以通過 NKG2D/DAP10信號(hào)通路抑制NK細(xì)胞的殺傷活性和INF-γ產(chǎn)生能力，miR-30c-1*可能在此過程中發(fā)揮了一定的作用［3-5］;另有研究證實(shí)，HMBOX1在小分子化合物ABO誘導(dǎo)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化過程中發(fā)揮了重要的促分化作用［6］。

肝癌嚴(yán)重危害中國(guó)人的健康。多年來，肝癌的死亡率一直高居不下［7-9］。前期我們通過組織芯片觀察到肝癌腫瘤組織中HMBOX1的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，這提示我們HMBOX1可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。HMBOX1同家族分子被證實(shí)具有一定的抗腫瘤作用，但有關(guān)HMBOX1與腫瘤的關(guān)系尚未闡明。因此，本文通過基因過表達(dá)和基因芯片技術(shù)，研究了HMBOX1與肝癌的關(guān)系，并首次證明了該基因可能參與了腫瘤和免疫相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 主要化學(xué)試劑和載體 PrimeSTAR高保真Taq酶、NheⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司);T4DNA連接酶(Fementes公司);M-MLV、TRIzol、LipofectineTM2000(Invitrogen公司);MTT(Sigma公司);pGEM-TEasy克隆載體(Promega公司);pEGFP-N1真核表達(dá)載體(Clontech公司);引物合成和序列測(cè)定(華大基因公司)。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系HepG2、PLC/PRF/5、人胚腎細(xì)胞HEK-293T和人正常肝細(xì)胞系 HL-7702(本實(shí)驗(yàn)室保存);293T、HepG2和PLC/PRF/5培養(yǎng)于DMEM(Gibco公司)完全培養(yǎng)基中，含有10%新生牛血清;HL-7702培養(yǎng)于 RPMI1640(Gibco公司)完全培養(yǎng)基中，含有10%胎牛血清;大腸桿菌DH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.3 RT-PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系中HMBOX1的表達(dá) 提取細(xì)胞的總RNA，利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增內(nèi)參β-actin引物:上游引物 P1:5'-ATGGGTCAGAAGGATTCCTAT-3'，下游引物 P2:5'-AGGCGTACAGGGATAGCACA-3';擴(kuò)增HMBOX1引物:上游引物P1:5'-AGCATGGGTCAGAGGTCATACAG-3'，下游引物 P2:5'-GGAAAGTACCAGATGTGGCAG-3'。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為295bp和373bp。擴(kuò)增條件:95℃，1分鐘;95℃，30秒;58℃，30秒;72℃，30秒;32次循環(huán);72℃，10分鐘。

1.4 人HMBOX1全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增和克隆載體的構(gòu)建與鑒定 提取HepG2細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，高保真Taq酶擴(kuò)增人HMBOX1全長(zhǎng)片段。擴(kuò)增基因的引物:上游引物P1:CAGTG-3'，帶下劃線的序列為NheⅠ限制性內(nèi)切酶

1.5 人pEGFP:HMBOX1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用NheⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對(duì)構(gòu)建成功的克隆載體進(jìn)行雙酶切，并回收純化的HMBOX1全長(zhǎng)片段?；厥掌斡肨4連接酶與pEGFP-N1進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化后涂布平板(卡那霉素100μg/ml)，陽性克隆經(jīng)PCR、酶切初步驗(yàn)證后送華大基因測(cè)序。測(cè)序正確的克隆，進(jìn)行保種備用。

1.6 pEGFP:HMBOX1轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染根據(jù)LipofectineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書完成?；具^程如下:轉(zhuǎn)染前12小時(shí)將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，保證細(xì)胞呈80%左右的融合生長(zhǎng)狀態(tài)。轉(zhuǎn)染開始前，先將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無血清DMEM培養(yǎng)基，按照說明配制好質(zhì)粒與LipofectineTM2000混合物，并加入細(xì)胞中。6小時(shí)后，換成新鮮的含血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 細(xì)胞增殖能力分析 預(yù)先轉(zhuǎn)染不同載體的HepG2接種于96孔板，培養(yǎng)1～5天，各時(shí)間點(diǎn)摻入MTT，4小時(shí)后酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm、630nm處的吸光度，OD=OD570nm-OD630nm。

1.8 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期 預(yù)先轉(zhuǎn)染不同載體的HepG2，培養(yǎng)72小時(shí)后胰酶消化，PBS洗滌3次，75%乙醇固定4小時(shí)，RNase消化后，加入終濃度100μg/ml的碘化丙啶(PI)染色30分鐘，隨后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 基因芯片分析 預(yù)先轉(zhuǎn)染不同載體的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，收集細(xì)胞并加入TRIzol，置于-80℃?zhèn)溆?。收集的樣品由上海康成生物公司進(jìn)行檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以上所有結(jié)果都重復(fù)3次以上。采用SPSS15.0對(duì)兩組間數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HMBOX1在多種肝癌細(xì)胞中低表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞系 HepG2和 PLC/PRF/5中HMBOX1的mRNA水平明顯低于永生化的正常肝細(xì)胞系HL-7702(圖1A)，且灰度分析結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞系與正常肝細(xì)胞系中HMBOX1 mRNA水平有顯著性差異(圖1B)。

2.2 人HMBOX1過表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá) 通過RT-PCR擴(kuò)增得到大小約為1 280 bp的HMBOX1全長(zhǎng)片段(圖2A)，通過克隆載體構(gòu)建和篩選與驗(yàn)證，確定陽性克隆的測(cè)序結(jié)果與Gene Bank登錄的HMBOX1全長(zhǎng)序列(NM 024567.3)完全一致;然后，通過NheⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切pGEM-THMBOX1克隆載體，回收HMBOX1全長(zhǎng)片段并構(gòu)建HMBOX1與EGFP融合表達(dá)的載體，并經(jīng)過酶切和基因測(cè)序證實(shí)融合表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖2B)。將該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入工程細(xì)胞HEK-293T中，48小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染pEGFP:HMBOX1融合表達(dá)載體的HEK-293T細(xì)胞內(nèi)發(fā)出明亮的綠色熒光(圖2C)。PCR的結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染該載體的HepG2細(xì)胞HMBOX1基因的表達(dá)水平顯著升高(圖2D)。以上結(jié)果表明，HMBOX1::EGFP融合蛋白可在細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)，發(fā)揮其過表達(dá)效應(yīng)。

2.3 HMBOX1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期的影響 與轉(zhuǎn)染空載體組相比，直至第5天，轉(zhuǎn)染pEGFP:HMBOX1融合表達(dá)載體組HepG2細(xì)胞的增殖能力未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3A)。流式的檢測(cè)結(jié)果顯示，空載體組與轉(zhuǎn)染融合表達(dá)載體組相比，細(xì)胞周期未發(fā)生顯著性變化(圖3B)。以上的結(jié)果說明，HMBOX1對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期無顯著影響。

圖1 腫瘤細(xì)胞系和永生化肝細(xì)胞系HMBOX1 mRNA的表達(dá)Fig.1 HMBOX1 mRNA expression of hepatoma cell lines and immortalized hepatocytes

2.4 HMBOX1對(duì)腫瘤及免疫相關(guān)信號(hào)通路的影響

通過基因芯片技術(shù)，分析了轉(zhuǎn)染空載體與pEGFP:HMBOX1融合表達(dá)載體的HepG2細(xì)胞內(nèi)顯著變化的基因。分析發(fā)現(xiàn)，這些顯著變化基因所涉及的信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生和免疫應(yīng)答相關(guān)。其中，在表達(dá)上調(diào)基因所涉及的信號(hào)通路中，變化最顯著的5個(gè)信號(hào)包括p53信號(hào)通路和腫瘤代謝信號(hào)通路、與免疫相關(guān)的NOD樣受體、A型流感和HTLV感染相關(guān)信號(hào)通路(圖4A);在表達(dá)下調(diào)基因所涉及的信號(hào)通路中，變化最顯著的5個(gè)信號(hào)通路包括細(xì)胞粘附信號(hào)通路和免疫缺陷信號(hào)通路，與青少年發(fā)病型成人糖尿病(MODY)有關(guān)的信號(hào)通路變化最為顯著(圖4B)。

圖2 HMBOX1過表達(dá)載體構(gòu)建及在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig.2 Construction of HMBOX1 over-expression plasmid and its expression in cells

圖3 過表達(dá)HMBOX1對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effects of HMBOX1 on the proliferation and the cell cycle of Hep G2 cells

3 討論

肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，中國(guó)更是肝癌的高發(fā)區(qū)，每年死于肝癌的患者占全世界感染死亡總數(shù)的54%［10］。由于其發(fā)病機(jī)制尚不明了，使得肝癌的治療面臨很多困難［11］。因此，若能在肝癌發(fā)病機(jī)制方面取得突破性的進(jìn)展，必將具有重要的理論價(jià)值和社會(huì)意義。

1985年首次報(bào)道了Homeobox基因，該家族的基因含有一段保守的 DNA序列，稱之為 homeodomain。Homeobox基因編碼的蛋白多數(shù)都為轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育初期都處于較高的表達(dá)水平，起到控制胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的作用［12］。HMBOX1屬于Homeobox基因的肝細(xì)胞核因子(HNF)基因簇，同基因簇基因HNF-1α具有顯著的抗腫瘤活性，能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［13］。有關(guān)HMBOX1的研究才剛剛起步，集中于其對(duì)NK細(xì)胞功能及骨髓基質(zhì)細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的調(diào)控作用，但具體的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。目前，有關(guān)HMBOX1與腫瘤的關(guān)系的研究尚處于空白。

圖4 過表達(dá)HMBOX1對(duì)HepG2細(xì)胞腫瘤和炎癥相關(guān)信號(hào)通路的影響Fig.4 Influence of HMBOX1 on the tumor-associated and inflammation-associated signal pathways in HepG2 cells

本研究首先證實(shí)，與正常肝細(xì)胞相比，多種肝癌細(xì)胞系中存在HMBOX1低表達(dá)現(xiàn)象，這一重要結(jié)果提示我們HMBOX1可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程。根據(jù)這一重要推測(cè)，本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了pEGFP:HMBOX1融合表達(dá)載體，并驗(yàn)證了其在真核細(xì)胞內(nèi)能有效過表達(dá)HMBOX1。將構(gòu)建的HMBOX1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到HepG2細(xì)胞，觀察了細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示HMBOX1并不會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期產(chǎn)生顯著的影響。

為了全面了解HMBOX1對(duì)肝癌的作用，我們用基因芯片技術(shù)對(duì)比分析了HMBOX1過表達(dá)與否對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果顯示，HMBOX1可能參與了腫瘤和免疫相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。HepG2細(xì)胞過表達(dá)HMBOX1后，在表達(dá)上調(diào)基因所涉及的信號(hào)通路中，變化顯著的5條信號(hào)通路全部與腫瘤和免疫相關(guān)，其中變化最為顯著的p53信號(hào)通路是目前研究較多的一條腫瘤信號(hào)通路，研究證實(shí)該通路的激活與阻斷與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系極為密切，野生型p53屬于抑癌基因，當(dāng)p53發(fā)生突變而失活時(shí)會(huì)引起腫瘤的發(fā)生，這也從側(cè)面證實(shí)HMBOX1可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程;變化顯著的信號(hào)還包括與腫瘤炎癥有密切關(guān)系的NOD樣受體信號(hào)通路、A型流感和HTLV-I感染相關(guān)信號(hào)通路［14-17］。在表達(dá)下調(diào)基因所涉及的信號(hào)通路中，前5條變化顯著的通路有兩條與腫瘤和免疫相關(guān)，其中變化最顯著的是MODY通路，此通路中涉及多個(gè)Homeobox家族分子，這可能也從另一方面證明了該家族的轉(zhuǎn)錄因子常常是成群地共同調(diào)控某個(gè)基因［18］。

本研究首次證明了HMBOX1在多種肝癌細(xì)胞系中存在低表達(dá)現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)HMBOX1可能與腫瘤和免疫之間存在一定的相關(guān)性，為HMBOX1與腫瘤關(guān)系的研究奠定了基礎(chǔ)，但還需要有更多的細(xì)胞株和更為充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以證實(shí)。

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