高 茜，管 瑩，米其利，李雪梅，繆明明，夭建華

(云南煙草科學(xué)研究院,云南 昆明 650106)

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell，CHO cell)因其生長(zhǎng)快、易培養(yǎng)等特性，被廣泛應(yīng)用于生物工程和多種化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)[1～3]。對(duì)于CHO工程細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)而言，細(xì)胞密度與存活率是影響細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的重要因素之一[4，5]；而在毒理學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)如中性紅細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，接種的細(xì)胞密度對(duì)實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果也有較大的影響[6]。因此，在大規(guī)模的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中需要快速準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞存活率計(jì)算。

傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)板法易受操作細(xì)節(jié)影響，精確性得不到保證，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。流式細(xì)胞儀法由于具有快速定量的特點(diǎn)，近年來(lái)在多種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)如細(xì)胞周期測(cè)定、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、細(xì)胞分選中都得到應(yīng)用，但流式細(xì)胞儀在細(xì)胞計(jì)數(shù)方面的應(yīng)用主要是定性地分辨血液細(xì)胞中不同標(biāo)記的細(xì)胞比例[7，8]，而對(duì)CHO工程細(xì)胞的定量細(xì)胞計(jì)數(shù)卻未見(jiàn)報(bào)道。作者在此應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率計(jì)算，以期為CHO細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)及化學(xué)品的毒理學(xué)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS、胎牛血清，美國(guó)Giboco公司；胰蛋白酶，美國(guó)Invitrogen公司；PI(碘化丙啶染色劑)，美國(guó)Sigma公司；臺(tái)盼藍(lán)，上海索來(lái)寶公司。

流式細(xì)胞儀(Cell Lab Quanta SC High Resolution Flow Cytometry)、流式管，Beckman Coulter公司；CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司；二級(jí)生物安全柜，Heal Force公司；TS100-F-HMC型倒置顯微鏡，Nikon公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)Corning公司；XS204型分析天平(感量0.0001 g)，Mettler Toledo公司；DT5-5型離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CHO細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

在37 ℃水浴中復(fù)蘇CHO細(xì)胞，之后接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)在5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%，用胰蛋白酶消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌并離心后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。部分細(xì)胞用70%乙醇固定30 min，再用PBS洗滌后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞存活率計(jì)算

用移液槍將500 μL細(xì)胞懸液移至流式管中，加入5 μL 1 mg·mL-1PI，輕輕吹打均勻后避光染色5～10 min，放入流式細(xì)胞儀進(jìn)樣位置。打開(kāi)流式細(xì)胞儀，第一次計(jì)數(shù)時(shí)選擇Counting程序，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)電子體積(EV)及側(cè)向散射光(SS)的值使細(xì)胞群位于合適的位置，并分別調(diào)節(jié)EV圖及SS圖中Counting的范圍去除碎片干擾，再根據(jù)PI的熒光強(qiáng)度(FL3)設(shè)定死活細(xì)胞范圍，并保存程序?yàn)镃HO cell counting。以后計(jì)數(shù)時(shí)選擇CHO cell counting程序來(lái)讀取數(shù)據(jù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)為SS圖的統(tǒng)計(jì)值，細(xì)胞存活率為FL3圖的統(tǒng)計(jì)值。

1.2.3 應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞存活率計(jì)算

將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。用移液槍將50 μL細(xì)胞懸液移至離心管中，加入50 μL 0.1%臺(tái)盼藍(lán)染液，染色3 min后將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入。將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的4個(gè)大格(每個(gè)大格含有16個(gè)中格)中的細(xì)胞數(shù)及被染液染上色的細(xì)胞數(shù)。按下式計(jì)算細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度及細(xì)胞存活率：

2 結(jié)果與討論

2.1 建立流式細(xì)胞儀進(jìn)行CHO細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞存活率計(jì)算的方法

流式細(xì)胞儀是根據(jù)EV和SS2個(gè)參數(shù)來(lái)識(shí)別CHO細(xì)胞的，由于不同細(xì)胞的大小和性質(zhì)不同，要根據(jù)不同的細(xì)胞調(diào)整EV與SS的Gain值以使細(xì)胞易于分析。設(shè)置EV=0.16、SS=3.6，CHO細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后得到的流式散點(diǎn)圖如圖1所示。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CHO細(xì)胞散點(diǎn)圖(SS/EV)

由圖1可以看出，消化的CHO細(xì)胞分散狀況良好，大部分都是單細(xì)胞狀態(tài)。

由于細(xì)胞在消化處理的過(guò)程中會(huì)受到一定的損傷，并且存在一些未消化完全的細(xì)胞團(tuán)，為了排除這些因素的影響，分別設(shè)定SS及EV2個(gè)參數(shù)的范圍以更精確地進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)SS參數(shù)和EV參數(shù)去除細(xì)胞碎片、細(xì)胞團(tuán)及細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)的直方圖見(jiàn)圖2。

圖2 CHO單細(xì)胞范圍直方圖

PI(碘化丙啶)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能夠透過(guò)死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，在488 nm激發(fā)光下使細(xì)胞核紅染[9]。因此，可用PI作為計(jì)算細(xì)胞存活率的染料，熒光強(qiáng)度低的為活細(xì)胞，熒光強(qiáng)度高的為死細(xì)胞。CHO細(xì)胞的PI著色直方圖見(jiàn)圖3。

圖3 未處理(a)和70%乙醇處理(b)CHO細(xì)胞的PI著色直方圖

由圖3可以看出，未處理CHO細(xì)胞的PI著色圖的峰值范圍主要在100～102熒光范圍內(nèi)；70%乙醇處理后的CHO細(xì)胞的PI著色圖的峰值范圍主要在103～104熒光范圍內(nèi)。因此，可根據(jù)這兩個(gè)區(qū)域分別劃定活細(xì)胞及死細(xì)胞的范圍從而計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.2 兩種方法細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較

用流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板分別對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每種計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)3次并計(jì)算均值與SD值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 流式細(xì)胞儀法與血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算的細(xì)胞濃度

由表1可看出，流式細(xì)胞儀法計(jì)算結(jié)果與CHO細(xì)胞稀釋梯度一致，并且SD值較低，重復(fù)性好；血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算結(jié)果雖然也有一定的梯度，但與細(xì)胞稀釋梯度并不完全吻合，SD值也較高，計(jì)算結(jié)果重復(fù)性較差，需要多次計(jì)數(shù)才能獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果。

為了進(jìn)一步研究流式細(xì)胞儀法是否能替代血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行細(xì)胞濃度計(jì)算，對(duì)兩種方法的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀法與血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算的細(xì)胞濃度相關(guān)性分析

由圖4可以看出，兩種方法的相關(guān)系數(shù)R2=0.9341，表明相關(guān)性較好。

2.3 兩種方法細(xì)胞存活率計(jì)算結(jié)果比較

用流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板分別對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行存活率計(jì)算，每種方法計(jì)算3次并計(jì)算均值與SD值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 流式細(xì)胞儀法與血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算的細(xì)胞存活率

由表2可以看出，流式細(xì)胞儀法計(jì)算的存活率結(jié)果與CHO細(xì)胞處理方式一致，并且SD值較低，重復(fù)性好；血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算結(jié)果雖然也與CHO細(xì)胞處理方式基本吻合，但SD值較高，重復(fù)性較差，需要多次分析才能獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果。

為了進(jìn)一步研究流式細(xì)胞儀法是否能替代血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行細(xì)胞存活率計(jì)算，對(duì)兩種方法的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 流式細(xì)胞儀法與血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算的細(xì)胞存活率相關(guān)性分析

由圖5可以看出，兩種方法的相關(guān)系數(shù)R2=0.971，表明相關(guān)性很好。

3 結(jié)論

(1)應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率計(jì)算的關(guān)鍵為SS值限制、EV值限制、FL3范圍劃定3個(gè)步驟。通過(guò)SS值限制和EV值限制計(jì)算細(xì)胞濃度，通過(guò)FL3范圍劃定計(jì)算細(xì)胞存活率。

(2)應(yīng)用流式細(xì)胞儀計(jì)算的細(xì)胞濃度及細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，具有快速穩(wěn)定的特點(diǎn)。因此，在大規(guī)模的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，可以用流式細(xì)胞儀法替代血球計(jì)數(shù)板法對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行分析。

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