史 君 王 靜 王 星 孫艷宏 范曉梅 納仁高娃

1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051

心肌肥厚主要是由于心臟在長期壓力負荷過重的情況下，肥大的心肌需氧量增加，而冠狀動脈的供血量往往不能予以滿足，造成心肌缺血從而引起心肌重構(gòu)，其發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要是心肌細胞增大和纖維化。它還是心力衰竭的早期重要病理過程，也是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率升高的獨立危險因素[1]。近年來隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)心肌肥厚的逆轉(zhuǎn)可以降低心血管疾病的危險性[2]，且炎癥因子在心肌肥厚的形成中具有重要作用[3]，因此，心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制顯得尤為重要，但迄今各種炎癥因子在心肌肥厚發(fā)病機制中的確切作用尚不完全清楚。本實驗就細胞因子中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）在高血壓心肌肥厚大鼠血清和心肌中的表達變化進行研究，探討TNF-α和IL-6在心肌肥厚中所表達的作用，為今后的研究及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 心肌肥厚模型的制備

內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心提供的Wistar大鼠180～220g 20只，均用標準顆粒性飼料喂養(yǎng)。按照預(yù)期實驗要求喂養(yǎng)1周后隨機分為兩組，即心肌肥厚組和假手術(shù)組，每組10只。參照Anderson方法制作壓力負荷性心肌肥厚大鼠模型[4]。假手術(shù)組中，利用手術(shù)分離大鼠一小段腹主動脈后，穿過一消毒手術(shù)縫線，但不作結(jié)扎，內(nèi)臟恢復(fù)原位后關(guān)閉腹腔，繼續(xù)飼養(yǎng)。各組大鼠術(shù)后按要求飼養(yǎng)8周，以戊巴比妥鈉麻醉后稱重，斷頭取血，摘取心臟。測取左心室重計算心室重與體重比值（LVW/BW）作為心肌肥厚指數(shù)。

1.2 動脈收縮壓（SBP）的測定

分別取各組大鼠，將其放入Power Lab系統(tǒng)配備的大鼠固定器內(nèi)，露出鼠尾，將尾根部放在烤燈下加熱5～10 min，使鼠尾動脈充分擴張后，將其穿過加壓尾套并固定于鼠尾根部，使大鼠尾部腹面正中與Power lab ML125／R（澳大利亞埃德儀器有限公司生產(chǎn)）無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)的脈搏傳感器緊密接觸，然后觀測系統(tǒng)的脈搏波形，當(dāng)出現(xiàn)穩(wěn)定的脈搏波時即可開始測定血壓。動物安靜后給尾套充氣加壓，可見脈搏波逐漸減小至消失，然后尾套開始放氣，鼠套壓力降低，當(dāng)壓力等于收縮壓時，開始出現(xiàn)脈搏波，此點的血壓值即動脈收縮壓。重復(fù)測量3次，取平均值，以kPa表示。

1.3 血清TNF-α、IL-6水平的測定

術(shù)后飼養(yǎng)8周處死大鼠，采取斷頭取血法，抽取4 mL血樣，然后離心分離血清，-20℃保存。測定前先置室溫復(fù)融，混勻后，利用4℃ 3000 r/min離心5 min，取上清液，嚴格按試劑盒說明書進行（分析試劑盒由北京東雅生物技術(shù)研究所提供）加樣操作。

1.4 RT-PCR法擴增大鼠TNF-α及IL-6基因

1.4.1 引物設(shè)計和合成 具體引物由上海申友生物公司合成，包括：β-actin上游引物 5-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；β-actin 下游引物 5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′；TNF-α 上游引物 5′-TGT TGT AGC AAA CCC TCA AG-3′；TNF-α 下游引物 5′-AAG TAG ACC TGC CCA GAC T-3′；IL-6 上游引物 5′-CAC TCA CCT CTT CAG AAC GA-3′；IL-6 下游引物 5-TGG CAT TTG CAT TTG TGG TTG GGT-3′，以上使用前均稀釋成 10 μmol/L。

1.4.2 實驗操作步驟 取30 mg心肌組織，采用TRIZOL一步法提取組織總RNA，應(yīng)用RT-PCR法檢測大鼠心肌組織中IL-6及TNF-α基因的表達水平。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司，按照說明書進行加樣操作。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP計算機圖像掃描分析系統(tǒng)測定電泳條帶密度值，以β-actin為內(nèi)參照，計算TNF-α mRNA及IL-6 mRNA的相對含量，結(jié)果以TNF-α、IL-6條帶占β-actin條帶密度的百分率（%）表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，經(jīng)半定量處理后的實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用配對t檢驗，確立檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌肥厚大鼠收縮壓和心指數(shù)的變化

與假手術(shù)組比較，心肌肥厚組術(shù)后8周動脈收縮壓升高（P ＜ 0.05），心指數(shù)明顯增加（P ＜ 0.05）。 見表 1。

表1 心肌肥厚組和假手術(shù)組SBP、LVW/BW的變化（，n=10）

表1 心肌肥厚組和假手術(shù)組SBP、LVW/BW的變化（，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) SBP（kPa） LVW/BW（mg/g）心肌肥厚組假手術(shù)組101026.4±0.3*15.7±0.53.0±0.4*2.4±0.2

2.2 心肌肥厚大鼠血清中TNF-α、IL-6含量變化

腹主動脈部分結(jié)扎手術(shù)后8周，血清TNF-α、IL-6含量增加，與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 心肌肥厚組和假手術(shù)組TNF-α、IL-6血清含量的變化（，n=10）

表2 心肌肥厚組和假手術(shù)組TNF-α、IL-6血清含量的變化（，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) TNF-α（μg/L） IL-6（ng/L）心肌肥厚組假手術(shù)組10103.5±0.8*1.9±0.4443.1±176.2*174.3±30.2

2.3 心肌肥厚大鼠心肌TNF-α、IL-6 mRNA表達的變化

PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，以反應(yīng)條帶在圖像分析系統(tǒng)內(nèi)行吸光度掃描進行半定量分析，IL-6 mRNA及TNF-α mRNA的相對含量用兩者條帶積分的灰度值與其相應(yīng)的β-actin的灰度值之比表示。與假手術(shù)組比較，心肌肥厚組心肌的 IL-6 mRNA及 TNF-α mRNA表達增加 （P＜0.05）。 見表 3。

表3 RT-PCR檢測兩組心肌IL-6及TNF-α mRNA結(jié)果（，n=10）

表3 RT-PCR檢測兩組心肌IL-6及TNF-α mRNA結(jié)果（，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) IL-6 mRNA TNF-α mRNA心肌肥厚組假手術(shù)組10100.51±0.05*0.22±0.030.69±0.05*0.21±0.02

3 討論

3.1 成功構(gòu)建心肌肥厚大鼠模型

心肌肥厚是指心肌細胞體積增大和心肌纖維增生[5]，是心臟對機械牽張和神經(jīng)體液刺激的一種主要反應(yīng)[6]。心肌肥大起初是一種對負荷增加或損傷的代償，但持續(xù)性心肌肥大則最終會因心功能失常而導(dǎo)致心力衰竭，因此探討其機制非常重要。本實驗參照Anderson方法制作壓力負荷性心肌肥厚大鼠模型，選取造模8周時進行數(shù)據(jù)研究。據(jù)文獻報道[7-9]，造模4周時心肌肥厚模型已經(jīng)建成，造模8周時模型比較穩(wěn)定。筆者在前期的實驗中分別通過造模4周和8周觀察到心肌肥厚組心肌細胞彌漫性肥大，畸形、核大、深染，心肌纖維走行紊亂，間質(zhì)增生。本實驗結(jié)果顯示心肌肥厚組SBP和LVW/BW顯著升高，說明成功制備心肌肥厚大鼠模型。

3.2 心肌肥厚大鼠血清和心肌中TNF-α、IL-6的水平變化及意義

TNF-α是炎性細胞因子之一，其具有多種效應(yīng)，目前認為TNF-α可以誘導(dǎo)心肌肥厚[10]。TNF-α對心肌的作用復(fù)雜多樣，可致心肌細胞凋亡[11]，也可引起心肌細胞肥大[12]。TNF對膠原纖維的生成和降解進行雙向調(diào)節(jié)[13-15]。據(jù)報道[10-11]在體外培養(yǎng)的乳鼠和成年貓科動物的心肌細胞中，TNF-α可誘導(dǎo)心肌肥大。王桂君等[16]研究結(jié)果顯示100 μg/L TNF-α能夠誘導(dǎo)心肌肥大，表現(xiàn)為蛋白合成、蛋白含量以及細胞體積增大，并增加心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度。IL-6也是一種炎性細胞因子，可致心肌細胞肥大，還有抗凋亡的作用。體外實驗中IL-6可直接引起心肌成纖維細胞膠原合成的增加。Flesh等[17]在機械張力刺激的實驗中觀察到中等程度的拉長心肌細胞時IL-6輕微增加，20 min后TNF-α無變化，60 min后IL-6也不再變化，而在心肌細胞嚴重拉長時則導(dǎo)致TNF-α、IL-6逐漸增加至較高水平，同時TNF-α、IL-6受體表達也增多。轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，條件是在心臟同時過表達IL-6和IL-6受體。綜上所述，炎癥因子TNF-α、IL-6參與心肌肥厚過程，但這些研究多集中于離體心臟或培養(yǎng)的心肌細胞層面，而炎癥細胞因子在疾病過程中對心臟肥大的實際效應(yīng)以及在體外實驗和整體動物中的參與程度和方式會有不同。本實驗從整體水平出發(fā)，參照Anderson方法制作壓力負荷性心肌肥厚大鼠模型，選取TNF-α、IL-6兩種炎癥細胞因子，觀察它們在心肌肥厚大鼠血清和心肌中的表達變化。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，心肌肥厚組大鼠血清TNF-α、IL-6含量增加（P<0.05）；肥厚心肌中TNF-α、IL-6 mRNA表達增加（P<0.05）。提示TNF-α、IL-6參與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展，其機制可能是：縮窄大鼠腹主動脈致心肌后負荷增加，從而使心臟做功增加，耗氧增多，代謝產(chǎn)物堆積，同時心臟神經(jīng)體液等因素的激活使核因子-κB（NF-κB）、活化蛋白-1（AP-1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子（STAT）活化[18]，可產(chǎn)生一些細胞因子及無菌性炎癥，其中包括TNF-α及IL-6的增加。而TNF-α及IL-6在心肌細胞上的異常表達，可刺激各種生長因子[19-20]的表達，這些生長因子作用于心肌細胞，促使其肥大[21]。實驗中還觀察到血清和心肌中TNF-α、IL-6水平均升高，變化一致，可能是壓力負荷增加導(dǎo)致心肌中TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成增加，使得進入血液循環(huán)的TNF-α、IL-6增多，進一步刺激心肌肥厚產(chǎn)生。因此，從本實驗的觀測結(jié)果可以得知：炎性細胞因子TNF-α、IL-6參與心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展過程。

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