張平平 甄 莉

山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院皮膚科，山西 太原 030001

銀屑病是一種常見并易復發(fā)的慢性炎癥性皮膚病。近年來，對銀屑病發(fā)病機制的研究日益深入，多數(shù)學者認為，銀屑病與免疫功能紊亂有關[1]。目前認為，T細胞介導的免疫紊亂是銀屑病發(fā)生發(fā)展的基礎。由于免疫調節(jié)主要是通過細胞因子之間的相互作用來實現(xiàn)的，因而，細胞因子在銀屑病發(fā)病中的作用愈來愈受到人們的重視。白細胞介素-1β（IL-1β）是重要的細胞因子之一，在銀屑病皮損中由活化的T淋巴細胞釋放。楊琴等[2]用IL-1β干預HaCat細胞后發(fā)現(xiàn)，人防御素-2 mRNA的表達增加，且銀屑病患者β防御素-2（HBD-2）表達增強。有研究顯示，防御素有抗菌的作用，但當防御素大量表達時與IL-1β共同作用可使?jié)冃越Y腸炎患者的炎癥加劇。本研究采用實時熒光定量RT-PCR技術在轉錄水平檢測銀屑病皮損中HBD-2、IL-1β mRNA表達情況，以觀察兩者是否共同參與了銀屑病的發(fā)病過程?，F(xiàn)將實驗具體情況報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年5月～2010年5月于我院皮膚科門診就診及住院的銀屑病患者45例，均具有典型皮損并經病理確診。排除標準：不伴有合并系統(tǒng)性疾病者，入組時至少1周未外用糖皮質激素，取材前3個月內未系統(tǒng)使用過免疫抑制劑、糖皮質激素、免疫增強劑者。采用銀屑病皮損面積及嚴重度指數(shù)（PASI）進行評分，45例患者 PASI評分為 6.9～55.2分，其中，將 0～24分作為輕度組 （25例），25～48分作為中度組（12例），49～72分作為重度組（8例）。45例患者中，男 25例，女20例；年齡18～65歲，平均31.8歲。選擇15例皮膚組織正?；颊咦鳛檎φ战M，均為于我本院進行整形外科手術的非銀屑病患者，其中，男9例，女6例；年齡16～56歲，平均34.5歲。

1.2 儀器及試劑

熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司）、TL988型實時熒光定量PCR儀 （西安天隆科技有限公司）、Y200C型電泳儀 （北京君意東方電泳設備有限公司）、JY-SCZ型電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）、離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。RT-PCR逆轉錄試劑盒和TransZol試劑分別由寶生物工程有限公司和北京全式金生物技術有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 取材及標本處理 皮損區(qū)取材：銀屑病皮損區(qū)切取典型皮損。非皮損區(qū)取材：銀屑病皮損周圍約1 cm處外觀正常皮膚切取標本，均于-70℃冰箱內保存。

1.3.2 提取RNA 嚴格按照TransZol溶液試劑盒說明書進行操作提取RNA，每管樣品取5 μL置1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳完畢后用溴化乙錠染色20 min，置紫外燈下觀察。紫外分光光度計測吸光度值及計算樣品濃度，并保存樣品于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 逆轉錄合成 cDNA 反應體系 10 μL：5×PrimeScriptR

Buffer 2 μL，PrimeScriptR RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer0.5 μL，Random 6mers0.5 μL，Total RNA 2 μL[0.5 μg/μ]，RNase Free dH2O 4.5 μL。 反應條件： 37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.3.4 RT-PCR擴增 取25 μL cDNA進行RT-PCR反應。預變 性 ：95℃ 30 s，1 個 循 環(huán) ；PCR 反 應 ：95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，40個循環(huán)；72℃延伸 7 min，然后 4℃ 5 min保存。引物序列：Human-actin上游引物5'AGAGCTACGAGCTGCCTGAC 3'， 下游引物 5'AGCACTGTGTTGGCGTACAG 3'，產物長度為184 bp。HBD-2上游引物 5'ATTCCTGATGCCTCTTCC 3'，下游引物 5'GTGCCAATTTGTTTATACCTTC 3'，產物長度為 117 bp；IL-1β上游引物 5'GGGCCTCAAGGAAAAGAATC3'，下游引物 5'TTCTGCTTGAGAGGTGCTGA3'，產物長度為205 bp。反應結束后，得出Ct值，將原始Ct值進行2-△Ct轉換，從而達到線性關系。相對定量的方法即比較Ct值法（2-△△Ct法）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；組間兩兩比較采用Bonferroni法，皮損、非皮損和正常對照組兩兩比較校正檢驗水準α'=0.017，P＜0.017為差異有統(tǒng)計學意義；皮損輕、中、重組和正常組兩兩比較校正檢驗水準α'=0.0083，P＜0.0083為差異有統(tǒng)計學意義。指標間相關性分析采用Pearson或Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBD-2、IL-1β mRNA在尋常型銀屑病患者皮損區(qū)、非皮損區(qū)和正常皮膚表皮中的表達情況

HBD-2、IL-1β mRNA在銀屑病皮損組的表達高于正常對照組和銀屑病非皮損組，且二者在銀屑病非皮損組的表達高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1。

2.2 HBD-2、IL-1β mRNA在不同等級銀屑病皮損組中的表達情況

HBD-2、IL-1β mRNA在輕、中、重度皮損中的表達逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 HBD-2、IL-1β mRNA在正常皮膚、銀屑病患者非皮損區(qū)及皮損區(qū)的表達情況（）

表1 HBD-2、IL-1β mRNA在正常皮膚、銀屑病患者非皮損區(qū)及皮損區(qū)的表達情況（）

注：與正常對照組比較，★P＜0.017；與銀屑病非皮損組比較，※P＜0.017

組別 例數(shù) HBD-2 mRNA IL-1β mRNA銀屑病皮損組銀屑病非皮損組正常對照組4545150.74±0.13※★0.32±0.04★0.11±0.010.64±0.15※★0.46±0.13★0.20±0.03

表2 HBD-2、IL-1β mRNA在不同等級銀屑病皮損中的表達情況（）

表2 HBD-2、IL-1β mRNA在不同等級銀屑病皮損中的表達情況（）

注：與正常對照組比較，※P＜0.0083

組別 例數(shù) HBD-2 mRNA IL-1β mRNA輕度組中度組重度組正常對照組25128150.64±0.07※0.80±0.06※0.94±0.05※0.11±0.010.56±0.10※0.67±0.10※0.87±0.12※0.20±0.03

2.3 銀屑病皮損區(qū)HBD-2、IL-1β mRNA的表達與PASI評分的相關性

HBD-2、IL-1β mRNA的表達與PASI評分呈正相關關系（P ＜ 0.05，r=0.887、0.771）。

2.4 HBD-2、IL-1β mRNA在銀屑病皮損區(qū)表達的相關性

在銀屑病皮損區(qū)HBD-2 mRNA與IL-1β mRNA表達呈正相關關系（P ＜ 0.05，r=0.691）

3 討論

銀屑病是一種免疫異常性慢性炎癥增生性皮膚病。人們最初認為，銀屑病原發(fā)于人角質形成細胞素紊亂。后來隨著研究的深入，銀屑病發(fā)病機制中目前較為公認的是T細胞介導的免疫機制[3]。IL-1β是重要的細胞因子之一，在銀屑病皮損中由活化的T淋巴細胞釋放。在銀屑病等病理情況下，IL-1β和成熟IL-1β蛋白表達均有增加[4]。劉瑋等[5]培養(yǎng)條件下IL-lβ誘導正常人皮膚表達銀屑病的免疫病理表型，提示IL-1β參與了銀屑病的皮損形成。本研究結果顯示，IL-1β在銀屑病皮損區(qū)表達顯著加強，并與PASI評分呈現(xiàn)正相關，再次證實了IL-1β與銀屑病皮損的形成有密切關系。

β防御素（HBD）家族是重要的天然免疫效應分子，其中包括 HBD-1、HBD-2、HBD-3、HBD-4 等[6]。1997 年 Harder等[7]從銀屑病患者病損上皮分離純化出HBD-2，此后，在包皮、肺、氣管、口腔黏膜、皮膚的上皮組織中均發(fā)現(xiàn)其表達。除正常組織外，HBD-2主要在感染刺激后的皮膚和黏膜組織中表達[8]，提示HBD-2在宿主抵御微生物感染方面發(fā)揮重要作用。既往研究表明，HBD-2為可誘導性防御素，其表達可被許多物質上調，如 IL-1β、TNF-α、細菌、真菌、脂多糖等[9-10]。Bajaj-Elliott等[11]研究發(fā)現(xiàn)，細胞毒性幽門螺桿菌和IL-1β顯著上調胃上皮細胞系AGS和MNK7細胞表達HBD-2。楊琴等[2]用IL-1β干預HaCat細胞后，發(fā)現(xiàn)人-防御素2 mRNA的表達增加。常玉英等[12]研究表明，阻斷HBD-2后，下調Caco2細胞株對TNF-α和IL-1β mRNA水平的表達，且兩者具有時效關系，提示HBD-2可能促進TNF-α和IL-1β的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病時HBD-2與IL-1β均表達增加且隨皮損加重而表達增高，并與PASI評分呈現(xiàn)正相關關系，提示IL-1β與HBD-2之間可能存在互相作用而使皮損加重，可能共同參與了銀屑病的發(fā)病過程，然而具體信號轉導通路是如何存在，值得進一步深入研究。

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[12]常玉英.防御素在炎癥性腸病發(fā)病機制中的作用及其分子機制研究[D].成都：四川大學，2006.