李 驊 謝艷華 張邦樂 王劍波 楊 倩 曹 蔚 王四旺

1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室，陜西 西安 710032

雙丹口服液收載于《中國藥典》2010年版一部，是由丹參、牡丹皮兩味中藥組成的成方制劑，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛之功效，臨床多用于瘀血痹阻所致的心胸痹痛[1]。丹參素、原兒茶醛和沒食子酸分別為丹參、牡丹皮中的重要活性成分[2-5]，現(xiàn)行質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅將丹參素作為雙丹口服液的指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定，而原兒茶醛和沒食子酸作為藥材的主要有效成分，與全方藥效密切相關(guān)。因此，同時(shí)測定這3種成分的含量對于雙丹口服液的質(zhì)量控制具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)建立了分離效果好、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的反相高效液相色譜法（RP-HPLC）同時(shí)測定雙丹口服液中丹參素、原兒茶醛和沒食子酸含量的方法，可為完善雙丹口服液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考[1,6-8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC2010-AT高效液相色譜儀（Shimadzu，日本），包括紫外可見波長檢測器、柱溫箱、LC Solution色譜工作站；賽多利斯ME235S電子分析天平（Sartorius，德國）。

1.2 試藥

雙丹口服液 （北京嘉事大恒制藥有限公司，批號：090709、100608、100706）；沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110831-200302），丹參素鈉對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110855-200706），原兒茶醛對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110810-200506）；甲醇為色譜純（Honeywell，美國，純度為70%），水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Sino Chrom ODS-BP C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）柱；流動相：甲醇-3%冰醋酸（8∶92）；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取對照品沒食子酸、丹參素鈉、原兒茶醛適量，精密稱定，置于同一10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，制成混合對照品儲備溶液，濃度分別為1.50、1.00、1.00 mg/mL。所得對照品儲備液4℃冰箱避光、密封保存，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取1 mL雙丹口服液于50 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度；取適量稀釋液，10714r/min高速離心15 min，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備 按處方工藝制備不含丹參、牡丹皮的樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

照上述色譜條件，精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各20 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，可見供試品色譜圖中，在與對照品色譜圖相應(yīng)的位置上，均有相同保留時(shí)間的色譜峰，同時(shí)3個(gè)待測組分沒食子酸、丹參素、原兒茶醛色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，陰性樣品對測定無干擾，見圖1。

圖1 雙丹口服液液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對照品儲備溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用 70%甲醇稀釋并定容于 10 mL容量瓶中。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測定。結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得沒食子酸、丹參素、原兒茶醛回歸方程分別為：Y=48450X-77657 （r=0.9998）、Y=14275X-25376 （r=0.9999）、Y=84203X-35716 （r=0.9998）。結(jié)果表明，沒食子酸、丹參素、原兒茶醛分別在5.0～100.0、7.5～150.0、5.0～100.0 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一濃度混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果沒食子酸、丹參素、原兒茶醛的RSD分別為為0.23%、0.50%、0.29%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液（批號：100608），分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣 20 μL，測定峰面積。結(jié)果沒食子酸、丹參素、原兒茶醛的RSD分別為0.62%、1.05%、0.52%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號供試品（批號：100608）6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測定3個(gè)成分的峰面積，計(jì)算得供試品中沒食子酸、丹參素、原兒茶酸含量分別為0.91、2.83、0.46 mg/mL，RSD 分別為 0.41%、0.21%、0.03%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已測知含量的同一批供試品（批號：100608）6份，每份1.00 mL，精密加入1 mL混合對照品儲備溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。沒食子酸、丹參素、原兒茶醛加樣回收率（n=6）依次為 99.2%、99.8%、100.3%，RSD 依次為 0.82%、0.94%、0.65%。

2.9 樣品含量測定

取批號為090709、100608、100706雙丹口服液，按制備供試品溶液方法制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定3次。見表1。

表1 雙丹口服液中沒食子酸、丹參素、原兒茶醛含量測定結(jié)果（mg/mL，n=3）

3 討論

3.1 流動相的選擇

沒食子酸、丹參素和原兒茶醛極性均較大，宜采用水相比例較大的流動相，且由于受其結(jié)構(gòu)中酚羥基的影響，都存在測定時(shí)易拖尾的現(xiàn)象，流動相中加入適量酸可抑制其拖尾，改善峰形對稱性?？疾炝思状?1%冰醋酸水溶液[1]、甲醇-2%冰醋酸水溶液、甲醇-3%冰醋酸水溶液，測定顯示采用甲醇-3%冰醋酸水溶液（8∶92，V/V）所得樣品峰形好，干擾成分少，保留時(shí)間合適，故選此作為流動相。

3.2 色譜柱的選擇

根據(jù)所選流動相，色譜柱應(yīng)耐酸并能承受較大水相，試驗(yàn)中曾試用 Yilite Hypersil BDS C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱、YiliteSinoChromODS-BPC18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱、PhenomenexLunaC18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱、Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，最后確定使用Yilite Sino Chrom ODS-BP C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm） 色譜柱。

3.3 其他色譜條件的選擇

全波長掃描 （210～400 nm）結(jié)果顯示沒食子酸在230、273 nm有最大吸收，丹參素在234、281 nm，原兒茶醛在235、280和312 nm有最大吸收，因在230 nm附近溶劑峰對3個(gè)成分色譜峰干擾較大，故選擇280 nm為檢測波長?？疾旖Y(jié)果顯示，柱溫及流速等的改變對含量測定的結(jié)果影響不大。

3.4 溶液的制備

考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇作為溶劑溶解樣品對色譜分離情況的影響，結(jié)果顯示純甲醇溶解樣品會產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，使得色譜峰前延，影響分離效果。綜合考慮，以70%甲醇為溶劑，其色譜峰對稱性較好，基線也較平穩(wěn)。

綜上所述，本文建立的HPLC法能同時(shí)測定雙丹口服液中沒食子酸、丹參素和原兒茶醛的含量，方法操作簡便，省時(shí)快捷，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可為完善雙丹口服液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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[4]黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊（下冊）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1994：1040.

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