伍尚標(biāo) 陳 戎 全天一 李志發(fā)

廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510150

MicroRNA（minRNAs）又稱微小 RNA，是一類不具有蛋白質(zhì)編碼功能的單鏈RNA，一般長(zhǎng)度僅為25個(gè)核苷酸左右。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA在生物體中參與許多生理病理過(guò)程，并發(fā)揮著極其重要的作用。其參與的細(xì)胞分裂、分化及凋亡活動(dòng)中與腫瘤的關(guān)系最為密切。

直腸癌作為消化道惡性腫瘤極為常見(jiàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)我國(guó)直腸癌患者明顯增多，發(fā)病率上升明顯，嚴(yán)重威脅人民身心健康。因此，早診斷、早治療對(duì)直腸癌患者的預(yù)后改善有著極其重要的意義。

以MicroRNA為主要研究方向的癌癥靶向治療及其腫瘤分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為世界熱點(diǎn)課題，具有很廣泛的應(yīng)用前景，但是MicroRNA在直腸癌誘發(fā)機(jī)制中的作用研究還處于起步階段[1-2]。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)的大量應(yīng)用，為基因在腫瘤調(diào)控機(jī)制中的作用提供技術(shù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院2009年1月～2011年6月實(shí)施手術(shù)治療的直腸癌患者60例，其中，男37例，女23例，患者中位數(shù)年齡49歲，標(biāo)本均通過(guò)病例檢驗(yàn)為直腸癌。在術(shù)中分離直腸腫瘤組織和遠(yuǎn)離腫瘤組織的正常直腸樣本，并即時(shí)采用液氮凍存。

1.2 試劑與儀器

RNAiso Plus （TaKaRa）， Premix Ex TaqVersion 2.0，（TaKaRa），RNA PCR Kit （AMV）Ver.3.0 （TaKaRa）， 伊文藍(lán)（Invitrogen），T4 多核苷酸激酶（Invitrogen），[r-32P]ATP（北京原子能研究所），7500 Fast熒光定量 PCR 儀（ABI）。

1.3 RNA提取

低溫環(huán)境下使用一次性RNase-free塑料器皿，對(duì)上述收集的我院60例直腸癌患者腫瘤組織和遠(yuǎn)離腫瘤組織的正常直腸樣本標(biāo)本研磨，應(yīng)用Total RNA提取試劑RNAiso Plus經(jīng)行總RNA提取。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度。OD260/OD280（R）值在 1.8～2.0 之間。

1.4 引物及探針的合成

根據(jù)Chen、Schmittgen等[3-4]所述設(shè)計(jì)并挑選部分前體miRNA設(shè)計(jì)PCR引物，并以miRNA-47和miRNA-152反向互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)Northern blot探針（由美國(guó)Invitrogen公司合成）。

1.5 MicroRNA的反轉(zhuǎn)錄PCR

取 1 μL 總 RNA 進(jìn)行 RT-PCR，20℃孵育 15 min，50℃反應(yīng)30 min，95℃ 5 min得到cDNA。PCR反應(yīng)條件，94℃預(yù)變性 5 min，90℃變性 30 s，55℃退火 30 s，70℃延伸 90 s，35個(gè)循環(huán)。

1.6 Northern印跡雜交

取20 μL總RNA與甲酰胺1∶1混合，進(jìn)行尿素SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的膜與被[r-32P]ATP標(biāo)記的探針雜交。內(nèi)參選定為5S rRNA。

1.7 MicroRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以制備好的cDNA為模板，熒光染料為伊文藍(lán)，設(shè)定ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀參數(shù)為：95℃預(yù)變性2 min，95℃ 10 s，60℃ 40 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.8 PAM法分析

對(duì)MicroRNA在直腸癌組織及其癌旁正常組織中表達(dá)量進(jìn)行分析，根據(jù)表達(dá)量變化對(duì)標(biāo)本進(jìn)行癌和非癌定性判斷。隨機(jī)選取直腸癌組織40例，確定判斷標(biāo)準(zhǔn)即直腸癌組織與癌旁正常組織中表達(dá)量比值低于0.66。對(duì)另外20例標(biāo)本組織進(jìn)行組內(nèi)隨機(jī)編號(hào)，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)顯著表達(dá)差異的MicroRNA，然后進(jìn)行20例標(biāo)本組織中癌和非癌定性鑒定，即可進(jìn)行判定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行Student檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MicroRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以管家基因U6 RNA做內(nèi)參，用△△Ct法對(duì)Real-time PCR結(jié)果分析。其中，△△Ct=Ct miRNA-Ct U6，每個(gè)MicroRNA相對(duì)表達(dá)量為2-（△△Ct）。直腸癌組織與癌旁正常組織中表達(dá)量比值低于0.66的MicroRNA有41種。見(jiàn)表1。

2.2 Northern印跡雜交

根據(jù)Real-time PCR結(jié)果，隨即選取miRNA-152進(jìn)行Northern blot。miRNA-152 表達(dá)量降低（圖 1），與其 Real-time PCR結(jié)果吻合，可旁證實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果準(zhǔn)確可信。

2.3 PAM分析

根據(jù)60例直腸癌標(biāo)本篩選出的具有與癌旁正常結(jié)腸組織顯著表達(dá)差異的MicroRNA，對(duì)另外20例組內(nèi)隨即編號(hào)的直腸癌組織與其正常直腸組織進(jìn)行定性判斷，即組內(nèi)樣品中MicroRNA表達(dá)量顯著降低的標(biāo)本即可判定為直腸癌組織。其結(jié)果與病理檢驗(yàn)完全一致，吻合率為100%。

3 討論

直腸癌是發(fā)達(dá)國(guó)家常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[5]，近年來(lái)我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民生活水平不斷提高，伴隨而來(lái)的卻是直腸癌發(fā)病率年增長(zhǎng)速度的居高不下，年增率已接近4%，2倍于世界平均水平。直腸腫瘤通常是由直腸黏膜病變，而逐漸演變?yōu)橄倭鰻钕⑷?，最后形成惡性腫瘤，瘤的形成較慢。如果在發(fā)病初期進(jìn)行干預(yù)治療，直腸癌患者可達(dá)90%的存活率，但是，早期直腸癌患者并無(wú)顯著癥狀，有40%以上的患者屬于中晚期，預(yù)后較差，存活率大大降低。因此，直腸癌發(fā)生分子機(jī)制的研究對(duì)于早期診斷治療具有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

表1 60例直腸癌組織（T）及其癌旁正常結(jié)腸組織（N）中miRNA的比較（）

表1 60例直腸癌組織（T）及其癌旁正常結(jié)腸組織（N）中miRNA的比較（）

名稱 T/N 名稱 T/N 名稱 T/N 名稱 T/N miRNA-1 miRNA-7 miRNA-23a miRNA-23b miRNA-30a miRNA-30b miRNA-30d miRNA-32 miRNA-100 miRNA-125a miRNA-125b 0.19±0.04 0.42±0.04 0.23±0.09 0.46±0.08 0.36±0.05 0.54±0.05 0.52±0.11 0.48±0.13 0.46±0.10 0.46±0.06 0.39±0.07 miRNA-126 miRNA-130a miRNA-130b miRNA-133a miRNA-133b miRNA-136 miRNA-139 miRNA-143 miRNA-144 miRNA-145 miRNA-149 0.08±0.11 0.27±0.10 0.30±0.05 0.51±0.05 0.57±0.04 0.38±0.06 0.34±0.10 0.35±0.12 0.44±0.08 0.49±0.10 0.21±0.03 miRNA-150 miRNA-152 miRNA-181 miRNA-192 miRNA-193a miRNA-193b miRNA-194 miRNA-195 miRNA-196b miRNA-204 miRNA-212 0.22±0.11 0.30±0.08 0.48±0.05 0.52±0.06 0.19±0.04 0.39±0.08 0.17±0.12 0.28±0.13 0.22±0.06 0.10±0.05 0.36±0.05 miRNA-214 miRNA-215 miRNA-221 let-7a let-7b let-7c let-7e let-7g 0.36±0.09 0.33±0.08 0.47±0.10 0.24±0.12 0.39±0.06 0.31±0.08 0.30±0.05 0.29±0.10

圖1 直腸癌與癌旁正常組織miRNA-152表達(dá)變化（Northern blot）

最近對(duì)MicroRNA的研究已經(jīng)成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。研究表明，腫瘤發(fā)生或個(gè)體的腫瘤易感性都與MicroRNA擴(kuò)增和變異有相關(guān)性。很多MicroRNA的調(diào)控靶位點(diǎn)與抑癌基因偶聯(lián)，若這類MicroRNA功能紊亂則可導(dǎo)致下游基因表達(dá)的改變，進(jìn)而可能會(huì)引發(fā)腫瘤的形成。據(jù)研究，有占50%以上的MicroRNA位于癌相關(guān)基因序列中，其隨著癌基因的表達(dá)而發(fā)生明顯變化[6-7]。因此，研究關(guān)鍵MicroRNA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制和鑒定，可以作為腫瘤研究新的標(biāo)記分子，開(kāi)創(chuàng)腫瘤分子診斷學(xué)和癌癥臨床治療學(xué)的進(jìn)新時(shí)代。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)60例直腸癌標(biāo)本的MicroRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中有41種MicroRNA的表達(dá)量顯著下降，并用Northern印跡雜交進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果一致。經(jīng)PAM分析MicroRNA作為直腸癌檢驗(yàn)依據(jù)結(jié)果可靠，方法可行。MicroRNA作為新的直腸癌標(biāo)志物，具有靈敏度高、檢驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于直腸癌早期篩查和普查。同時(shí)，由于能作為檢驗(yàn)的MicroRNA種類多，所以能夠避免個(gè)體差異而產(chǎn)生的檢驗(yàn)錯(cuò)誤。

綜上，作為直腸癌的早期診斷和細(xì)胞靶向治療，對(duì)MicroRNA檢測(cè)都有臨床價(jià)值。但是MicroRNA在腫瘤中的作用機(jī)制還未完全明確，在臨床應(yīng)用方面還未深入進(jìn)行[8-9]。相信隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不段進(jìn)步，在直腸癌的早期有效診治方面MicroRNA將發(fā)揮極其重要的作用。

[1]Guamieri DJ，DiLeone Pd.MicmRNAs：a new class of gene regulators[J].Ann Med，2008，40（3）：197-208.

[2]Cheng HY，Obrietan K.Revealing a role of microRNAs in the regulation Ann Med，2008，40（3）：197-208.

[2]Cheng HY，Obrietan K.Revealing a role of microRNAs in the regulation of the biological clock[J].Cell Cycle，2007，6（24）：3034-3035.

[3]Chen CF，Ridzon DA，Broomer AJ，et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res，2005，7（4）：33-79.

[4]Sehmittgen TD，Jiang J，Liu Q，et al.A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors[J].Nucleic Acids Res，2004，1（3）：32-43.

[5]Jemal A，Siegel R，Ward E.Cancer statistics 2007[J].CA Cancer J Clin，2007，57（2）：43-66.

[6]Esquela Kerscher A，Slack FJ.Oncomirs-mieroRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer，2006，6（3）：259-269.

[7]Calin GA，Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers [J].Nat Rev Cancer，2006，6（12）：857-866.

[8]Jay C，Nemunatitis J，Chert P，et al.miRNA profiling for diagnosis and prognosis of human cancer[J].DNA Cell Biol，2007，26（13）：270-293.

[9]Gartel AL，Kandel ES.miRNAs：Little known mediators of oncogenesis[J].Semin Cancer Biol，2008，18（3）：103-110.