陳紹成 ，胡太德，況 剛，賀繼喜，崔 虹

(1.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067; 2.重慶市食品藥品檢驗所，重慶 401121;3.重慶市萬州區(qū)中醫(yī)院，重慶 404000)

接骨止痛口服膏是重慶市萬州區(qū)中醫(yī)院自配制劑，由骨碎補、三七、白芍、木瓜、制川烏、土鱉蟲、當歸、陳皮、大黃(制)等12味中藥組方，具有養(yǎng)血活血、接骨止痛的功效，臨床療效顯著。為了更好地控制制劑質(zhì)量，保證其療效，筆者在原質(zhì)量標準的基礎上進一步試驗，建立了方中三七、當歸、白芍的薄層色譜鑒別方法，制川烏中烏頭堿限量檢測方法以及芍藥苷含量測定的高效液相色譜法，使接骨止痛口服膏的質(zhì)量標準得以完善和提高。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);硅膠G(青島海洋化工有限公司)。芍藥苷對照品(批號為110736－200934，含量測定用，含量95.7%)、土鱉蟲對照藥材(批號為121489)、大黃對照藥材(批號為 1249－0301)、大黃酚對照品(批號為 110796－201013)、大黃素對照品(批號為0756－2001107)、當歸對照藥材(批號為 120927－200613)、阿魏酸對照品(批號為 110773－201012)、白芍對照藥材(批號為0905－200106)均購于中國藥品生物制品檢定所;乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純;接骨止痛口服膏(重慶市萬州區(qū)中醫(yī)院，批號為20101105，20101108，20101109)。

2 方法和結果

2.1 薄層色譜鑒別

三七:取樣品20 g，加水20 mL，混勻，每次用20 mL正丁醇振搖提取2次，分取正丁醇液，再每次以20 mL水洗滌2次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液[1]。取不含三七的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。另取對照藥材三七，同法制成對照藥材溶液。再取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1，加甲醇制成每1 mL含0.5mg的對照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點于以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜及對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點;置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照無干擾 (圖 1)。

當歸:取本品20 g，加1%碳酸氫鈉溶液50 mL，超聲處理10 min，離心，取上清液，用稀鹽酸調(diào)pH至2～3，加乙醚振搖提取兩次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[2]。取不含當歸的陰性樣品20 g，同法制成陰性對照品溶液。另取對照藥材當歸0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取阿魏酸對照品，用甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲苯－甲酸(1∶4∶0.1)為展開劑，展開，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜及對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾(圖2 A)。

白芍:取本品20 g，加水20 mL，搖勻，用正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次20 mL，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含白芍的陰性樣品20 g，同法制成陰性對照品溶液。另取白芍對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取對照品芍藥苷，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，對照藥材溶液和對照品溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，噴10%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點，陰性對照無干擾(圖 2 B)。

圖1 三七薄層色譜圖

圖2 當歸薄層色譜圖

2.2 烏頭堿限量檢查

取本品20 g，加20 mL水混勻，置分液漏斗中，加氨試液20 mL，放置2 h，加乙醚60 mL，振搖1 h，放置過夜，分取乙醚液，水液再用乙醚振搖提取2次，每次40 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[3]。取不含制川烏的陰性樣品20 g，同法制成陰性對照品溶液。另取烏頭堿對照品，加無水乙醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液及陰性對照品溶液10 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯－乙酸乙酯－二乙胺(14∶4 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上，呈現(xiàn)的斑點應小于對照品的斑點或不出現(xiàn)斑點，陰性無干擾(圖3)。

2.3 芍藥苷含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Shim－pack C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:1.0 mL/min;檢測波長:230 nm;流動相:乙腈－0.1%磷酸溶液(16∶84);柱溫:40℃;進樣量:10 μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于2000。在此色譜條件下，芍藥苷色譜峰與相鄰的色譜峰可達到基線分離，陰性對照無干擾。色譜圖見圖4。

2.3.2 溶液制備

精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含30 μg的對照品溶液。取本品約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。另取不含白芍的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

圖3 制川烏薄層色譜限量檢查

線性關系考察:精密稱取芍藥苷對照品0.01599 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，依法進樣測定峰面積。以進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并按最小二乘法計算得直線回歸方程，Y=12.944X －4.4211，r2=0.9999(n=5)。結果表明，芍藥苷進樣量在 7.995～127.92 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗:取同一芍藥苷對照品溶液(0.03198 g/L)，連續(xù)進樣5次，測定峰面積。結果芍藥苷的平均峰 面 積 為 282.19，RSD=0.26%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為20101108)，依法制備6份供試品溶液，測定其芍藥苷含量。結果芍藥苷平均含量為0.117 mg/g，RSD=0.76%(n=5)，表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，分別于配制后 0，2，4，6，8，10 h依法進樣，測定芍藥苷峰面積。結果平均峰面積為231.82，RSD=0.76%(n=6)，表明供試品溶液至少在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗:精密量取芍藥苷對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.1599 g/L，95.7%)2.0 mL，分別置 6 個具塞錐形瓶中，水浴上揮干溶劑;再稱取已測定含量的樣品(批號為20101108，芍藥苷含量為0.117 mg/g)約2.5 g，精密稱定，分別加入上述具塞錐形瓶中，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測定含量，計算加樣回收率。結果見表1。

圖4 高效液相色譜圖

表1 芍藥苷加樣回收試驗結果(n=6)

2.3.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，各進樣10 μL，按外標法計算芍藥苷的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

在芍藥苷的含量測定中，分別用甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇作為提取溶劑進行試驗，結果用甲醇作為提取溶劑時含量最高，故選擇甲醇為提取溶劑。曾考察了15，30，45，60 min超聲提取的效果，結果超聲處理15 min時含量較低，超聲處理30，45，60 min時含量較高但無顯著性差異，故選擇超聲處理30 min。

根據(jù)方中12味中藥材的化學特性及其在方中的作用，按君臣佐使對處方進行分析，首先考慮對君藥骨碎補、土鱉蟲和白芍進行薄層色譜鑒別研究。除白芍不受陰性干擾外，骨碎補以柚皮苷對照品[3－4]、骨碎補對照藥材[5]，土鱉蟲以土鱉蟲對照藥材[3，7]作對照，結果陰性均產(chǎn)生干擾，方法不成立，故未收入標準。同時，考慮到白芍作為方中的主藥，故對其進行了含量分析。

方中三七和當歸共為臣藥，對三七中的三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1進行了高效液相色譜[3]含量測定研究，但由于三七在方中的含量少，樣品中測得的三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1含量很低，且陰性對照有干擾，故未收入標準。

方中制川烏為佐藥，雖經(jīng)炮制、用量亦較少，但為了用藥安全，仍參照《中國藥典》及文獻[8]中關于制川烏的限量檢查方法，對制川烏作了限量檢查。該方法成熟，故收入標準。

曾對方中佐使藥木瓜、大黃、澤蘭、陳皮、生地黃亦參照文獻 [9－11]，按不同提取方法和不同展開劑進行了多種方案的薄層色譜鑒別，但陰性對照均有干擾，故未收入標準。

[1]WS3－B－1480－93，中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑(第八冊)[S].

[2]WS3－B－3905－98，中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑(第二十冊)[S].

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:36.

[4]韓麗萍，梁 達，劉志剛.補腎壯骨顆粒質(zhì)量標準的研究[J].解放軍藥學學報，2009，25(2):145 －147.

[5]趙新杰，夏華玲.特制接骨丸的質(zhì)量標準研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(6):1007.

[6]李 鋒，戴啟良.土鱉蟲及其偽品的紫外光譜鑒別研究[J].藥物分析雜志，1995，15(A01):461 －462.

[7]DY－2010(03)－01，中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·新藥轉正中藥標準(第13冊)[S].

[9] 李家實.中藥鑒定[M].上海:上?？萍技夹g出版社，1996:111，113，805.

[10]康延國.中成藥薄層色譜鑒定[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:126，398.