李立順， 錢晶晶， 時維靜

(安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽233100)

銀苦黃白口服液為臨床經(jīng)驗(yàn)方研制，由金銀花、苦參、黃芪、白茅根按6∶7∶7∶10組成。具有清熱祛濕，利水的功效，臨床用于腎炎、腎盂腎炎、尿毒癥等療效顯著。方中苦參系豆科植物苦參Sophora flavescens Air.的干燥根［1］，具有清熱燥濕，利水的功效，其主要活性成分是苦參堿、氧化苦參堿［2］。銀苦黃白口服液采用的是水提醇沉制備工藝，為考察共煎對方中化學(xué)成分的影響，本試驗(yàn)采用L8(27)正交設(shè)計(jì)，考察不同配伍對苦參堿、氧化苦參堿含有量的影響，以探討該方的配伍化學(xué)變化規(guī)律，為制備工藝的改進(jìn)提供研究數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CAMAG LINOMAT5半自動點(diǎn)樣儀;CAMAG TLC Scanner 3薄層色譜掃描儀;winCATS軟件，瑞士卡瑪;CP225D準(zhǔn)微量天平，德國賽多利斯;RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;LG10-24A離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 試藥 黃芪 Astragalus membranaceua(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao.產(chǎn)地內(nèi)蒙古;白茅根 Imperata cylindrical Beauv.Var.major C.E.Hubb.產(chǎn)地安徽;金銀花Lonicera japonica Thunb.產(chǎn)地河南;苦參Sophora flavescens Ait.產(chǎn)地安徽。均購自安徽京皖中藥飲片廠，藥品生產(chǎn)許可證號:皖Y20020003批號20100319。經(jīng)時維靜教授鑒定為正品。

苦參堿 (110805-200306)、氧化苦參堿 (0780-200004)，購自中國藥品生物制品檢定所;硅膠薄層板G，20 cm×10 cm，購自青島海洋化工廠，批號20070724;試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 L8(27)配伍的正交設(shè)計(jì) 選黃芪、金銀花、白茅根作為3個因素，選用藥和不用藥為2個水平，同時考慮兩兩交互作用，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.2 供試溶液制備 按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)配比稱取各味藥材，加8倍量水浸30 min，煎提2次，每次1 h，合并濾液，靜置12 h，取上清液。濃縮至每1 mL相當(dāng)于1.5 g藥材，加乙醇使含醇量達(dá)75%，靜置，上清液回收乙醇，精濾，調(diào)整溶液量，使苦參含量均達(dá)35%，如法制備缺苦參樣品 (見表2)。精密吸取各樣品1 mL，過短中性氧化鋁柱(100～200目2 g，內(nèi)徑1 cm)，以50%甲醇洗脫約10 mL，洗脫液水浴蒸干后用甲醇溶解并定容至2 mL，冷藏備用。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取苦參堿、氧化苦參堿適量，分別置10 mL量瓶中，甲醇溶解至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的溶液。

表2 苦參不同配伍的用藥比例

2.4 薄層色譜條件 硅膠G板，板厚約0.3 mm;反復(fù)試驗(yàn)后，選定三氯甲烷-甲醇-濃氨試液 (10∶1.2∶0.2)為展開劑，置雙槽展開缸，飽和20 min。取缺苦參、苦參藥材、全方及苦參堿、氧化苦參堿溶液，半自動點(diǎn)樣儀噴霧條帶點(diǎn)樣各2 μL，帶寬6 mm，各2重復(fù)。置雙槽展開缸的另側(cè)預(yù)平衡15 min，上行展開8 cm，取出吹干，噴改良碘化鉍鉀試液 (碘化鉍鉀試液1 mL，加0.6 moL/L鹽酸溶液2 mL，加水10 mL)顯色劑，至顯色清晰。室溫15℃，相對濕度40%。此條件下，苦參堿、氧化苦參堿顯橘黃色斑點(diǎn)，分離較好，可同板比較，缺苦參樣品無干擾。見圖1。

圖1 苦參及全方薄層圖譜

2.5 薄層掃描條件 使用薄層掃描儀，全光譜掃描，苦參堿、氧化苦參堿顯色后，最佳檢測波長λ=530 nm;采用吸收檢測 (光源為鎢燈)，單波長反射直線掃描法，狹縫3.0 mm×0.45 mm，掃描速度20 mm/s。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取苦參堿、氧化苦參堿對照品各1、2、3、4、5 μL，各重復(fù)2次，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按2.4項(xiàng)展開、顯色，并按2.5項(xiàng)測定峰面積積分值，以對照品量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。二者的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍分別為:苦參堿的回歸方程為 Y=56.801+1.409X，r=0.99867，苦參堿點(diǎn)樣量在0.20～1.00 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;氧化苦參堿的回歸方程為Y=2374.410+13.580X，r=0.99996，氧化苦參堿點(diǎn)樣量在0.20～1.00 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 穩(wěn)定性考查 對一薄層板的同一斑點(diǎn)每間隔2h掃描測定1次，結(jié)果顯示斑點(diǎn)在10 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.7%(n=5)。

2.8 精密度考查

2.8.1 同板精密度 精密吸取苦參堿、氧化苦參堿對照品溶液2 μL，于同一硅膠G薄層板上連續(xù)點(diǎn)5次，按2.4項(xiàng)展開、顯色，并按2.5項(xiàng)測定峰面積積分值。結(jié)果苦參堿RSD為1.27%(n=5);氧化苦參堿RSD為0.51%(n=5)。

2.8.2 異板精密度 精密吸取苦參堿、氧化苦參堿對照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于5塊硅膠G薄層板上，按2.4項(xiàng)展開、顯色，并按2.5項(xiàng)測定峰面積積分值。結(jié)果苦參堿RSD為2.19%(n=5);氧化苦參堿RSD為1.88%(n=5)。

結(jié)果表明該方法的同板精密度、異板精密度均較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量樣品9份，分別精密加入適量苦參堿、氧化苦參堿對照品，按供試品溶液制備法制備，按上述薄層色譜條件及薄層掃描條件測定供試品溶液中苦參堿、氧化苦參堿的含有量。結(jié)果苦參堿平均加樣回收率為98.67%，RSD為3.67%(n=9);氧化苦參堿的平均加樣回收率為99.55%，RSD為1.94%(n=9)。2.10 配伍對苦參堿和氧化苦參堿含有量的影響 精密吸取表2中1－8號供試品溶液各2 μL，苦參堿1 μL、5 μL，氧化苦參堿1 μL、6 μL進(jìn)樣，各重復(fù)2次。按2.4項(xiàng)同板點(diǎn)樣、展開、顯色，并按2.5項(xiàng)測定峰面積積分值。采用線性回歸二點(diǎn)法計(jì)算含有量。測定不同配伍樣品苦參堿和氧化苦參堿的含有量見表3，方差分析見表4、表5。

表3 L8(27)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 苦參堿方差分析

表5 氧化苦參堿方差分析

從表3、4、5可以看出，苦參單味藥中苦參堿含有量最低，氧化苦參堿含有量最高。5號組 (金銀花、白茅根、苦參)苦參堿含有量最高。方差分析表明，黃芪與金銀花的交互作用對苦參堿含有量的影響具有顯著性差異 (P＜0.05)，即黃芪與金銀花共用或均不用苦參堿含有量較低;黃芪對氧化苦參堿含有量的影響具有顯著性差異 (P＜0.05)，白茅根對氧化苦參堿含有量的影響具有極顯著性差異 (P＜0.01);但當(dāng)白茅根與黃芪共同配伍苦參使用，明顯降低了氧化苦參堿的含有量。

3 討論

銀苦黃白湯是臨床治療腎炎、腎盂腎炎、尿毒癥的有效方。中藥復(fù)方用藥是中醫(yī)臨床治病的特色與靈魂［3］。方劑的藥效并不是單味藥效的簡單加和，而是遵循“君臣佐使”原則。強(qiáng)調(diào)方證關(guān)聯(lián)、病癥結(jié)合，使各味藥形成“有制之師”，針對相應(yīng)的證或病，達(dá)到“整體綜合調(diào)節(jié)”的效果［4］。中藥復(fù)方治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)是其中的化學(xué)物質(zhì)。在改劑型的過程中，只有明確其化學(xué)成分及其理化性質(zhì)，明確中藥有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，才有可能明確其制備過程的動態(tài)變化，才有可能實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性和臨床療效的確切性，才能保證中藥復(fù)方制劑等生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制和檢測［5］。

本項(xiàng)試驗(yàn)研究了銀苦黃白口服液不同配伍對苦參堿和氧化苦參堿含有量的影響。與配伍共煎相比苦參單味藥中苦參堿含有量最低，氧化苦參堿含有量最高，表明共煎不僅是增加了苦參堿的提取率，也有氧化苦參堿轉(zhuǎn)化為苦參堿可能［6］。3、4、5、6號共煎液中苦參堿和氧化苦參堿的總量高于單味苦參提取液的總量，其中5號 (苦參+銀花+白茅根) ＞4號 (苦參+黃芪) ＞6號 (苦參+銀花)＞3號 (苦參+黃芪+白茅根)，提示苦參與銀花、白茅根共煎能顯著增加苦參堿和氧化苦參堿的提取率;黃芪與金銀花共用或均不用組苦參堿含有量較低，提示黃芪與金銀花增加苦參堿提取率的途徑不同，共用時反而互相抑制，影響了苦參堿的提取;白茅根與黃芪共同配伍苦參使用，明顯降低了氧化苦參堿的含有量。從對苦參堿和氧化苦參堿含有量的影響角度，可以考慮黃芪不宜共煎。但對其他有效成分的影響及臨床療效的影響，還將進(jìn)一步研究，另文報(bào)導(dǎo)。

試驗(yàn)對比了多種展開劑，如苯-丙酮-醋酸乙酯-濃氨(2∶3 ∶4 ∶0.2)［7］，甲苯-丙酮-甲醇 (8 ∶3 ∶0.5)，甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水 (2 ∶4 ∶2 ∶1)［1，8］，環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮-濃試液 (4 ∶6 ∶8 ∶0.5)［9］，三氯甲烷-甲醇-水 (7 ∶2 ∶1)和三氯甲烷-甲醇 (5 ∶0.2)［10］，三氯甲烷-甲醇-濃氨試液 (5∶0.6∶0.3)等。因苦參堿和氧化苦參堿Rf值相差較大，有的對苦參堿展開效果較好，有的對氧化苦參堿展開效果較好，經(jīng)調(diào)整選定三氯甲烷-甲醇-濃氨試液 (10∶1.2∶0.2)為展開劑，可同板檢測兩項(xiàng)指標(biāo)。噴改良碘化鉍鉀試液為顯色劑，顯色穩(wěn)定。因CAMAG薄層色譜掃描儀具有自動扣除背景的作用，故選用單波長反射直線掃描，簡單、快速、準(zhǔn)確。

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