劉衛(wèi)根， 王亮生， 徐文華， 楊路存， 朱滿蘭， 周國英*

(1.中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810008;2.中國科學(xué)院植物研究所，北京100093;3.中國科學(xué)院研究生院，北京100049;4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京210095)

羌活原植物為傘形科羌活屬植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang和寬葉羌活Notopterygium franchetii H.de Boiss.，以其干燥根莖和根入藥［1］。羌活屬 Notopterygium為中國特有屬，隸屬于傘形科Umbelliferae，該屬包括5個(gè)種1個(gè)亞種［2-3］。按吳征鎰先生中國植物區(qū)系分區(qū)，羌活屬植物主要分布于中國—喜馬拉雅植物亞區(qū)的橫斷山脈地區(qū)、中國—日本森林植物亞區(qū)的黃土高原地區(qū)和青藏高原的唐古特地區(qū)［4］。

羌活不僅是羌醫(yī)藥體系中的重要藥材，而且在中、藏醫(yī)藥體系中也具有悠久的藥用歷史。藥理研究表明，羌活具有抗炎、鎮(zhèn)痛、散寒、祛風(fēng)、除濕等多種功效，對(duì)心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病也具有一定的療效［5］。揮發(fā)油、香豆素和有機(jī)酸類化合物是羌活中最主要的3大類活性成分，它們具有廣泛的生物活性，如綠原酸具有利尿抗炎等作用［6］，阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗血小板聚集、擴(kuò)張微血管、增加冠脈流量、解除血管痙攣、防止血壓升高等作用［7-8］，羌活醇和紫花前胡苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用［9-10］，這些活性成分的存在使得羌活具有獨(dú)特的藥效，因而應(yīng)用廣泛。

羌活藥材商品規(guī)格按產(chǎn)地不同分為川羌 (四川)和西羌 (甘肅、青海等);依據(jù)藥材性狀一般劃分為蠶羌、竹節(jié)羌、大頭羌和條羌4個(gè)商品等級(jí)［1，11］，其中上部根莖粗壯，節(jié)密，呈緊密隆起的環(huán)狀，全體圓柱略彎曲，形如蠶狀者為蠶羌;節(jié)間延長，形如竹節(jié)狀，習(xí)稱竹節(jié)羌;有的根莖粗大，不規(guī)則結(jié)節(jié)狀，頂部具數(shù)個(gè)莖基，根較細(xì)，習(xí)稱大頭羌;一般認(rèn)為蠶羌的質(zhì)量最優(yōu)，竹節(jié)羌次之，大頭羌、條羌最次。然而，這種等級(jí)劃分方法僅僅依靠其外部特征，而缺乏可靠的化學(xué)以及藥理學(xué)證據(jù)。本研究對(duì)不同商品等級(jí)野生羌活 (蠶羌、竹節(jié)羌、大頭羌、條羌)以及斷離的支根、細(xì)根(須根)中主要的有機(jī)酸和香豆素類化合物進(jìn)行了測(cè)定和比較，從化學(xué)角度探討羌活藥材傳統(tǒng)商品等級(jí)劃分的科學(xué)合理性，為其行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)規(guī)范和提高羌活藥材生產(chǎn)質(zhì)量以及更有效地利用羌活藥材具有重要意義。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 戴安 (Dionex)HPLC-DAD分析系統(tǒng)，包括P680泵、UltiMate 3000自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC—100柱溫箱、PDA—100光電二極管陣列檢測(cè)器以及Chromeleon(6.60版本)變色龍色譜工作站。

1.2 試藥 有機(jī)溶劑包括分析純甲醇、冰醋酸 (北京化工廠，中國);色譜純甲醇和乙腈 (MREDA TECHNOLOGY INC.，USA)，HPLC 級(jí)超純水由Milli-Q 超純水系統(tǒng) (Millipore，Billerica，MA，USA)制備。對(duì)照品阿魏酸 (批號(hào):110773-201012)和歐前胡素 (批號(hào):110826-201013)購自中國食品藥品檢定研究院;補(bǔ)骨脂素 (批號(hào):110322)和佛手柑內(nèi)酯 (批號(hào):110215)購自上海順勃生物工程有限公司;綠原酸 (批號(hào):ps08072303)、紫花前胡苷 (批號(hào):ps11032301)、異歐前胡素 (批號(hào):ps08040301)、羌活醇 (批號(hào)ps11050601)購自成都普斯生物科技有限公司，各對(duì)照品純度均在98%以上。羌活藥材于2010年8月采自青海省班瑪縣，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所周國英副研究員鑒定為傘形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang。將采回的藥材除去泥沙，自然陰干后，根據(jù)藥典所描述方法進(jìn)行不同商品等級(jí)歸類，并將斷離的細(xì)根、須根單獨(dú)歸為一類進(jìn)行研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為C18TSK gel ODS-80Ts QA(250 mm × 4.6 mm，5 μm，Tosoh Co.Ltd.，日本)。體積流量0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相A相為純甲醇，B相為0.3%的冰醋酸水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?0～15 min，25% ～38%A;15～17 min，38% ～38%A;17～45 min，38% ～50%A;45～55 min，50% ～75%A;55`70 min，75% ～85%A;70～75 min，85% ～25%A，75～80 min，25% ～25%A。柱溫30℃;檢測(cè)波長336 nm(紫花前胡苷)，325 nm(綠原酸和阿魏酸)，310 nm(佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素、歐前胡素)，295 nm(補(bǔ)骨脂素)?；旌蠈?duì)照品的色譜圖見圖1，樣品的色譜圖見圖2和圖3。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素各適量，以甲醇溶解，搖勻并定容，制成含綠原酸 (408.00 μg/mL)、阿魏酸 (400.00 μg/mL)、紫花前胡苷(400.00 μg/mL)、補(bǔ)骨脂素 (405.00 μg/mL)、佛手柑內(nèi)酯 (404.00 μg/mL)、歐前胡素 (403.00 μg/mL)、羌活醇 (400.00 μg/mL)和異歐前胡素(400.00 μg/mL)的混合對(duì)照品貯備液。

圖1 混合對(duì)照品的高效液相色譜圖 (325 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of eight reference substances at 325 nm

圖2 不同波長下蠶羌的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of silkworm Notopterygium under different wavelengths

2.3 供試品溶液的制備 參考《中國藥典》并結(jié)合文獻(xiàn)［12-13］，選擇以下提取條件:精密稱取羌活粉末 (過100目篩)0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理 (功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

圖3325 nm波長下蠶羌 (B)、竹節(jié)羌 (C)、大頭羌(D)、條羌 (E)和須根 (F)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of silkworm Notopterygium(B)，bamboo Notopterygium(C)，irregularnodal Notopterygium(D)，striped Notopterygium(E)and fibrous roots(F)at 325 nm

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品母液5、2.5、2 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，然后采用逐級(jí)稀釋的方法，用甲醇將上述不同濃度的混標(biāo) (包括母液)分別稀釋10n倍 (n=1，2，3)，得到一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液。每個(gè)濃度平行進(jìn)樣3針，進(jìn)樣量為10 μL，以對(duì)照品濃度 (X)為橫坐標(biāo)，平均峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各對(duì)照品的回歸方程。以逐步稀釋法測(cè)得8個(gè)成分的檢測(cè)限LOD值 (S/N=3)和定量限LOQ值 (S/N=10)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，各對(duì)照品在對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣濃度 (進(jìn)樣量)范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別在1 d內(nèi)和連續(xù)5 d精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，在所確定的HPLC條件下重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定。記錄各成分色譜峰面積，計(jì)算各對(duì)照品的濃度。結(jié)果表明，混合對(duì)照品溶液中，綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素濃度的日內(nèi)RSD分別為1.62%、0.49%、3.39%、0.27%、0.12%、3.33%、0.34%、1.05%，日間 RSD分別為 2.18%、0.61%、2.14%、1.96%、0.45%、1.24%、1.72%、1.98%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10 μL，分別在0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積計(jì)算混合對(duì)照品溶液中綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇和異歐前胡素的濃度，RSD分別為1.97%、0.52%、1.86%、1.71%、0.64%、2.22%、1.01%、1.51%，表明24 h內(nèi)8個(gè)對(duì)照品穩(wěn)定性良好。

表1 8個(gè)活性成分的回歸方程、檢測(cè)限和定量限Tab.1 Regression equations，LODs and LOQs for eight standards

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取6份蠶羌樣品，各約0.4 g，精密稱定，制備供試品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素6次測(cè)定值的RSD分別為2.36%、2.17%、3.19%、1.78%、1.32%、1.56%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取蠶羌樣品粉末0.1 g，分別精密加入已知量高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，并按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 加樣回收率試驗(yàn)Tab.2 Recovery of the eight bioactive compounds

2.9 樣品測(cè)定 精密稱取不同等級(jí)羌活樣品各0.4 g，按2.3項(xiàng)方法制備供試液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，每批平行測(cè)定3次，以外標(biāo)法用峰面積積分值計(jì)算羌活藥材中主要成分的含有量，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，蠶羌、竹節(jié)羌、大頭羌、條羌、須根中，綠原酸的含有量呈現(xiàn)下降趨勢(shì);對(duì)于阿魏酸，除竹節(jié)羌中阿魏酸含有量略低于大頭羌外，由蠶羌到須根總體也呈現(xiàn)下降趨勢(shì);綠原酸和阿魏酸二者含有量之和也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這說明所測(cè)有機(jī)酸的含有量與其傳統(tǒng)等級(jí)劃分方法基本相符，根莖 (蠶羌、竹節(jié)羌、大頭羌)中的含有量高于根 (條羌、須根)。

表3 不同商品等級(jí)羌活中主要有機(jī)酸和香豆素類化合物的比較Tab.3 Comparation of the contents of the main organic acids and coumarin compounds in different commercial parts of Notopterygium incisum

紫花前胡苷含有量最高的為條羌，其次為須根，由高到底依次為條羌＞須根＞竹節(jié)羌＞大頭羌＞蠶羌。佛手柑內(nèi)酯含有量最高的為須根，其次為大頭羌，由高到低為須根＞大頭羌＞條羌＞蠶羌＞竹節(jié)羌。羌活醇和異歐前胡素含有量最高的均為須根，其次為條羌。這說明，根 (須根、條羌)中這幾種常見的香豆素類化合物的含有量反而比根莖(大頭羌、竹節(jié)羌、蠶羌)中的含有量高，特別是羌活中主要的2種活性成分羌活醇和異歐前胡素在須根中的含有量要明顯高于其他部位，但傳統(tǒng)上須根往往被認(rèn)為藥用價(jià)值低或沒有藥用價(jià)值而被直接去除，因而沒能夠有進(jìn)入市場(chǎng)。因此，從本研究的結(jié)果來看，須根中活性成分含有量高，應(yīng)當(dāng)也具有較高的藥用價(jià)值，應(yīng)予以充分利用。

3 討論

3.1 提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙醇、水3種提取溶劑對(duì)提取效果的影響。結(jié)果表明:用水作提取溶劑對(duì)羌活醇、異歐前胡素等極性較小化合物的提取效果不佳，色譜峰主要集中在保留時(shí)間較小的一段，且峰面積明顯小于甲醇和乙醇所提樣品。乙醇和甲醇提取時(shí)，色譜圖基本一致，但甲醇提取時(shí)總色譜峰面積大于用乙醇提取，而且甲醇有利于直接進(jìn)行HPLC分析，故選擇純甲醇作為提取溶劑。

考慮到回流提取需要加熱，時(shí)間也較長，提取過程中化合物容易發(fā)生電離、氧化、水解等化學(xué)反應(yīng)，使得部分化學(xué)成分隨著提取過程而損失。此外，回流提取需要的有機(jī)溶劑也較多。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取作為提取方法。根據(jù)《中國藥典》所描述的方法及相關(guān)文獻(xiàn) ［12-13］，最終選擇如下提取條件:取羌活樣品0.4 g，加甲醇50 mL超聲提取 (功率250 W，頻率50 kHz)30 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 在建立分析方法前，對(duì)分析香豆素常用的流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察，比較了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)冰醋酸水溶液(0.1%、0.2%、0.3%)、甲醇-不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)冰醋酸水溶液 (0.1%、0.2%、0.3%)4種體系的分離效果，通過綜合比較，最終選擇甲醇-0.3%的冰醋酸水溶液作為流動(dòng)相體系，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察了該體系下不同柱溫 (25、30、35℃)、不同體積流量 (0.6、0.8、1.0 mL/min)對(duì)分離效果的影響，柱溫30℃，體積流量0.6 mL/min時(shí)分離效果佳。通過對(duì)照品在200～400 nm范圍內(nèi)的DAD全波長掃描結(jié)果可知，綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素的最大吸收波長分別為326、323、336、295、312、302、312、310 nm，本實(shí)驗(yàn)選擇336 nm(紫花前胡苷)，325 nm(綠原酸和阿魏酸)，310 nm(佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素、歐前胡素)，295 nm(補(bǔ)骨脂素)作為檢測(cè)波長，采用多波長法同時(shí)測(cè)定各成分。

3.3 多成分測(cè)定 不同商品等級(jí)的羌活中主要有機(jī)酸和香豆素的含有量存在差異，綠原酸、阿魏酸的含有量與傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法基本一致;但紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇和異歐前胡素的含有量與傳統(tǒng)的以外觀形態(tài)論品質(zhì)的判斷標(biāo)準(zhǔn)有一定的差異，在根 (條羌、須根)中的含有量反而高于根莖 (蠶羌、竹節(jié)羌、大頭羌)中的含有量。特別是羌活中2種主要的活性成分羌活醇和異歐前胡素在須根中的含有量要顯著高于其他部位。

本實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)和藥典所規(guī)定的等級(jí)劃分方法將采自同一產(chǎn)地的野生羌活分成5個(gè)部分，選擇羌活中幾種常見且容易購買到的對(duì)照品作為定量指標(biāo)，從有機(jī)酸和香豆素含有量的角度來評(píng)價(jià)不同等級(jí)間的內(nèi)在品質(zhì)，實(shí)驗(yàn)所用樣品采自同一產(chǎn)地，避免了市售樣品不同產(chǎn)地間的差異所帶來的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于正確認(rèn)識(shí)羌活藥材的內(nèi)在質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為從化學(xué)信息的角度修訂羌活藥材的商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:170-171.

［2］王幼平，溥發(fā)鼎，王萍莉，等.中國特有屬——羌活屬系統(tǒng)分類研究［J］.云南植物研究，1996，18(4):424.

［3］溥發(fā)鼎，王萍莉，鄭中華，等.重訂羌活屬的分類［J］.植物分類學(xué)報(bào)，2000，38(5):430-436.

［4］孫 輝，蔣舜媛，周 毅，等.藥用植物羌活現(xiàn)狀及其民族植物學(xué)調(diào)查［J］.世界科技研究與發(fā)展，2004，26(6):42-47.

［5］張明發(fā)，沈雅琴.羌活藥理學(xué)研究［J］.中國執(zhí)業(yè)藥師，2008，5(53):28-30.

［6］中華本草編委會(huì).中華本草［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:6732-6733.

［7］梁 娜，孫少平，羅躍娥，等.阿魏酸的研究進(jìn)展［J］.黑龍江中醫(yī)藥，2009(3):39-40.

［8］屈 揚(yáng)，黃 熙，任 平，等.HPLC法測(cè)定川芎當(dāng)歸的常見煎劑中阿魏酸的含量［J］.中草藥，2004，35(10):1123-1125.

［9］秦彩玲，張 毅，劉 婷，等.中藥羌活有效成分的篩選試驗(yàn)［J］.中國中藥雜志，2001，25(10):639.

［10］Okuyama E，Nishimura S，Ohmori S，et al.Analgesic component of Notopterygium incisum Ting［J］.Chem Pharm Bull，1993，41(5):926-929.

［11］董生健，朱宏偉，閻 鳳，等.甘肅省羌活資源利用與開發(fā)對(duì)策［J］.甘肅農(nóng)業(yè)，2006(5):179.

［12］李云霞.中藥羌活質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化研究 ［D］.沈陽:遼寧中醫(yī)學(xué)院，2004.

［13］王海波，邸 學(xué)，包永睿，等.中藥羌活HPLC-熒光指紋譜研究［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27(2):568-572.