羅 曼， 周 蘭， 申 璀， 熊慧林

(貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州貴陽(yáng)550004)

銀翹解毒丸由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子 (炒)、桔梗、淡竹葉、甘草九味中藥組成，具有疏風(fēng)解表，清熱解毒的功能。現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)有:《中國(guó)藥典》2005年版一部、《中國(guó)藥典》2010年版一部、《衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十四冊(cè)、 《衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十九冊(cè)、國(guó)家藥品監(jiān)管局標(biāo)準(zhǔn) (試行)WS-564(Z-110)-2002、國(guó)家藥品監(jiān)管局標(biāo)準(zhǔn) (試行)YBZ27002005。各標(biāo)準(zhǔn)收載的檢測(cè)指標(biāo)有顯微特征鑒別、薄層色譜定性鑒別及高效液相色譜定量測(cè)定等?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載的每種檢測(cè)指標(biāo)針對(duì)性強(qiáng)，但覆蓋面有限，僅針對(duì)性地對(duì)方中1～2種藥味進(jìn)行檢測(cè)，由于銀翹解毒丸處方藥味較多，難以反映檢測(cè)樣品的全貌，有必要建立有效手段全面評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量。中藥指紋圖譜及特征圖譜的研究應(yīng)用為更全面控制中成藥質(zhì)量提供了良好的研究前景，目前已有部分文獻(xiàn)報(bào)道采用指紋圖譜及特征圖譜探索成藥質(zhì)量控制研究［1-5］，但大部分指紋圖譜及特征圖譜的研究仍集中于單味藥材的質(zhì)量控制。銀翹解毒丸的研究報(bào)道主要為銀翹解毒丸定量測(cè)定研究［6-7］及處方中單味原料藥材的指紋圖譜及特征圖譜研究［8-11］，尚無(wú)銀翹解毒丸制劑特征圖譜的研究報(bào)道。根據(jù)本品法定標(biāo)準(zhǔn)收載的處方與制法模擬制備銀翹解毒丸10批，采用HPLC方法探索建立銀翹解毒模擬丸的特征圖譜，研究特征圖譜中特征峰的歸屬，為有效評(píng)價(jià)銀翹解毒丸的質(zhì)量提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 儀器和試藥

Aglient 1260液相色譜儀，Aglient 1260 DAD VL檢測(cè)器，HP液相色譜工作站。甲醇為色譜純(Tedia company)，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。參照物綠原酸 (中國(guó)藥品生物制品檢定所:110753-200413)、連翹苷 (中國(guó)藥品生物制品檢定所:110821-200609)、牛蒡苷 (中國(guó)藥品生物制品檢定所:110819-200505)。

處方中九味藥材各10批分別來(lái)源于廣西、江西、江蘇、貴州、浙江、內(nèi)蒙、湖南、陜西、河北、四川、甘肅、陜西、河南、吉林、山東、山西、新疆等地，經(jīng)本所中藥室熊慧林及貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定均符合2010年版《中國(guó)藥典》一部［12］要求。按銀翹解毒丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的處方與制法制備模擬丸劑10批，編號(hào)分別為WJ1～WJ10。

市售商品銀翹解毒丸5批，為四川省宜賓五糧液集團(tuán)宜賓制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品2批 (批號(hào)1008021，采樣地點(diǎn)四川;批號(hào)1008011，采樣地點(diǎn)四川)，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司產(chǎn)品3批(批號(hào)0035965，采樣地點(diǎn)山西;批號(hào)0035967，采樣地點(diǎn)遼寧;批號(hào)1036303采樣地點(diǎn)河北)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱 (4.6 mm ×250 mm);檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm，柱溫30℃;甲醇為流動(dòng)相A，0.2%磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行線性梯度洗脫，0～10 min，A由10%線性改變至20%，10～30 min，A線性改變至30%，30～50 min，A線性改變至37%，50～80 min，A線性改變至50%;檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸計(jì)不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品0.01973 g，置100 mL量瓶，加甲醇溶解稀釋至刻度;連翹苷對(duì)照品0.01362 g，置50 mL量瓶，加甲醇溶解稀釋至刻度;牛蒡苷對(duì)照品0.01058 g，置50 mL量瓶，加甲醇溶解稀釋至刻度;分別量取上述綠原酸對(duì)照品溶液2 mL，連翹苷對(duì)照品溶液1 mL，牛蒡苷對(duì)照品溶液5 mL，置同一10 mL量瓶，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液 (每1 mL各含綠原酸、連翹苷、牛蒡苷分別為 39.46 μg、27.24 μg 、105.8 μg)。對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the reference substances

2.3 供試品液制備 取模擬丸劑，研細(xì)，取約4.5 g，精密稱定，置具塞錐瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 銀翹解毒丸對(duì)照特征圖譜Fig.2 Standard chromatogram of simulated Yinqiao Jiedu Pills

2.4 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品 (重復(fù)性1)溶液各10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)下條件檢測(cè)，采用中藥色譜指紋圖譜的相似性計(jì)算軟件對(duì)6次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，其相似度均為0.99以上，以綠原酸峰為對(duì)照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0～0.07%，其相對(duì)峰面積的RSD值為0～0.98%，結(jié)果表明儀器等整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的供試品 (模擬丸一)共6份，精密稱定，按2.3項(xiàng)下制備，按2.1項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，6次測(cè)定的圖譜其相似度均為0.99以上，以綠原酸為對(duì)照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0～0.08%，其相對(duì)峰面積的RSD值為0～2.98%，結(jié)果表明同一批次的6份供試品色譜特征圖譜相似，沒(méi)有明顯的差異，方法的重復(fù)性良好，符合特征圖譜的要求。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.5項(xiàng)下同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)行檢測(cè)，獲得不同時(shí)間進(jìn)樣的供試品色譜其相似度均為0.99以上，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0～0.06%，相對(duì)峰面積的RSD值為0～3.15%。結(jié)果表明，在24 h內(nèi)銀翹解毒模擬丸的特征圖譜基本穩(wěn)定，沒(méi)有明顯的變化，符合特征圖譜的要求。

2.7 銀翹解毒丸樣品標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的建立 比較10批模擬丸供試品溶液譜圖的相關(guān)參數(shù)，結(jié)合重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)考查結(jié)果，刪除10批樣品色譜中平均相對(duì)峰面積小于0.03的色譜峰、重復(fù)性試驗(yàn)及穩(wěn)定性試驗(yàn)中相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD大于5%的色譜峰以及峰形不佳的色譜峰，發(fā)現(xiàn)色譜圖中14個(gè)峰 (包含S峰在內(nèi))為各批供試品共有，且符合特征圖譜方法考查的要求，因此確定這14個(gè)峰為其共有峰。綠原酸峰最大，選作為S峰，11號(hào)峰為連翹苷，13號(hào)峰為牛蒡苷 (見(jiàn)圖3)。10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間較一致，RSD為0～0.10%。10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜共有峰的相對(duì)峰面積差異較大，RSD為0～99.44%。銀翹解毒丸樣品標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜應(yīng)以相對(duì)保留時(shí)間為指標(biāo)建立，根據(jù)上述數(shù)據(jù)建立相應(yīng)的銀翹解毒丸的特征圖譜。10批銀翹解毒丸特征圖譜與標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜相似度在0.9以上 (見(jiàn)表1)。

2.8 銀翹解毒丸樣品特征圖譜特征峰歸屬 按照銀翹解毒丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的制法，制備分別缺失金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子(炒)、桔梗、淡竹葉、甘草等九味藥材的模擬陰性樣品。取上述9種陰性樣品，精密稱定，按2.3項(xiàng)下制備，按2.1項(xiàng)下條件檢測(cè)，將生成的陰性樣品圖譜與銀翹解毒丸樣品標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜進(jìn)行比較，確定特征峰的歸屬。經(jīng)圖譜比較，甘草、金銀花、連翹、牛蒡子4味藥材有明顯歸屬的色譜峰，分別為由5號(hào)，6號(hào)峰及其周圍1～3個(gè)小峰形成的組峰 (甘草)、S峰 (金銀花)、11號(hào)峰 (牛蒡子)、13號(hào)峰 (連翹)。如圖4，圖中GC-YX為缺甘草陰性樣品;GC為甘草;TYH-YX為缺金銀花陰性;LYS為綠原酸;NBZ-YX為缺牛蒡子陰性;NBG為牛蒡苷;LQ-YX為缺連翹陰性;LQG為連翹苷;YQJDW為銀翹解毒丸。

圖3 10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜Fig.3 Common chromatograms of ten batches of simulated Yinqiao Jiedu Pills

表1 銀翹解毒模擬丸樣品的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜相似度Tab.1 Similarity of simulated Yinqiao Jiedu Pills

2.9 樣品檢測(cè)評(píng)價(jià) 根據(jù)銀翹解毒模擬丸特征圖譜特征峰的歸屬，評(píng)價(jià)銀翹解毒丸?？紤]到原料藥材產(chǎn)地、采收時(shí)間、貯存條件以及生產(chǎn)工藝參數(shù)的差異，兼顧特征圖譜適用性，僅評(píng)價(jià)抽驗(yàn)樣品色譜圖中是否檢出2.8項(xiàng)中所述特征峰:5、6號(hào)峰及其周圍的1～2個(gè)小峰形成的組峰中的任一色譜峰(甘草)、S峰 (金銀花)、11號(hào)峰 (牛蒡子)、13號(hào)峰 (連翹)。經(jīng)考查特征圖譜重復(fù)性、穩(wěn)定性的相對(duì)保留時(shí)間和10批模擬丸劑的相對(duì)保留時(shí)間離散度很小，RSD均小于2%，故規(guī)定特征峰相對(duì)保留時(shí)間限度為±2%。根據(jù)10批次模擬丸特征圖譜特征峰的相對(duì)峰面積分布，綜合考慮樣品生產(chǎn)中多重因素的影響，確定除S峰外的特征峰的豐度最低不小于10批次模擬丸劑中相對(duì)峰面積均值的50%。

限度范圍為:應(yīng)檢出S峰 (金銀花)，5號(hào)峰(甘草組峰)～6號(hào) (甘草組峰)的相對(duì)保留時(shí)間區(qū)間內(nèi) ［1.827× (1±0.02)～1.861× (1±0.02)］至少一個(gè)相對(duì)峰面積不低于0.02的色譜峰，11號(hào)峰 (牛蒡子)相對(duì)保留時(shí)間為2.942×(1±0.02)且相對(duì)峰面積不低于0.2的色譜峰，13號(hào)峰 (連翹)為相對(duì)保留時(shí)間3.242×(1±0.02)且相對(duì)峰面積不低于0.04的色譜峰。

圖4 銀翹解毒丸特征圖譜特征峰定位Fig.4 Locating common chromatograms of Yinqiao Jiedu Pills

按本實(shí)驗(yàn)特征圖譜檢測(cè)法，測(cè)定市售銀翹解毒丸5批，均檢出金銀花、甘草、牛蒡子、連翹的特征峰，如圖5。

圖5 市售銀翹解毒丸特征圖譜Fig.5 Common chromatograms of Yinqiao Jiedu Pills in market

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)共有特征峰中最大的色譜峰綠原酸峰作指標(biāo)考查樣品的提取時(shí)間，以甲醇超聲處理30 min的測(cè)定值最高，增加提取時(shí)間，測(cè)定值不再增加，從而確定樣品提取方法為甲醇超聲處理30 min。

3.2 本實(shí)驗(yàn)探索考查了特征圖譜的色譜系統(tǒng)及檢測(cè)波長(zhǎng)。研究中嘗試了乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)的梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)色譜峰保留時(shí)間不夠穩(wěn)定，色譜圖變化較大。甲醇-0.2%磷酸系統(tǒng)較穩(wěn)定，但不同梯度洗脫結(jié)果存在較大差異，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定本實(shí)驗(yàn)所述的流動(dòng)相梯度分離效果及色譜峰形最佳。檢測(cè)波長(zhǎng)比較了230、240、260、270、279、320 nm，發(fā)現(xiàn)279 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)特征色譜峰較多，各特征色譜峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，雜質(zhì)干擾較少，故確定279 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 中藥特征圖譜技術(shù)是目前公認(rèn)的鑒別中藥品種和評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的有效手段，其優(yōu)點(diǎn)在于可全面反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分及其相對(duì)比例，在有效成分尚未完全闡明的情況下，可有效地表征中藥質(zhì)量。中藥色譜特征圖譜是一種綜合的，可量化的鑒別手段，是符合中藥特色的質(zhì)量控制模式之一［13］。本實(shí)驗(yàn)建立了銀翹解毒丸劑特征圖譜檢測(cè)方法，由于本品組方較為復(fù)雜由九味藥材組成，10批模擬丸中的九味藥材皆來(lái)源不同 (產(chǎn)地或批次不同)，10批銀翹解毒丸劑特征圖譜共有14個(gè)共有特征峰，綠原酸峰最大，選作為S峰，牛蒡苷、連翹苷分別為樣品的11號(hào)、13號(hào)共有特征峰。從結(jié)果分析，多數(shù)的商品藥材化學(xué)成分相對(duì)穩(wěn)定，質(zhì)量較高，相似度均大于0.9。由于藥材為天然產(chǎn)物，樣品的理化成分為其在自然界產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，其量的高低受產(chǎn)地、氣候、采收季節(jié)等因素的影響而不同，對(duì)于成藥而言影響因素還有生產(chǎn)過(guò)程中工藝參數(shù)的控制、運(yùn)輸及儲(chǔ)存等的影響。樣品中的理化成分種類的數(shù)量則相對(duì)穩(wěn)定，僅每種物質(zhì)的含有量或相對(duì)豐度存在差異?；谏鲜隹紤]，本實(shí)驗(yàn)考察了10批次的模擬丸，運(yùn)用《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件分析，評(píng)價(jià)模擬丸劑圖譜與10批模擬丸劑生成的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的相似性，其相似度在0.85以上。10批樣品中相對(duì)保留時(shí)間的離散度很小，14個(gè)共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均在0.11%以下。10批樣品中相對(duì)峰面積的離散度較大，14個(gè)共有特征峰的相對(duì)峰面積的RSD最高可達(dá)99.44%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品中的理化成分種類相對(duì)穩(wěn)定，而理化成分的量受多因素的影響存在較大的變化。

3.4 考慮到銀翹解毒丸批準(zhǔn)文號(hào)較多，全國(guó)大部分地區(qū)均有生產(chǎn)企業(yè)，不同地域生產(chǎn)企業(yè)投料用原料藥材可能存在較大差異如產(chǎn)地及批次等，很難確定一個(gè)極具代表性的產(chǎn)品?；谏鲜鲈颍緦?shí)驗(yàn)從全國(guó)各地收集經(jīng)鑒定符合2010年版《中國(guó)藥典》一部要求的九味原料藥材各10批，按法定標(biāo)準(zhǔn)的處方及制法自制銀翹解毒丸作為特征圖譜的探索性研究的試驗(yàn)對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)中模擬丸為試驗(yàn)室小試樣品與企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)存在差異，兩者特征性的差異有待進(jìn)一步研究。但作為多指標(biāo)定性質(zhì)量控制方法的建立，本實(shí)驗(yàn)研究具有一定的研究意義，實(shí)驗(yàn)建立的特征圖譜，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可有效地鑒別和評(píng)價(jià)銀翹解毒丸的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，為全面評(píng)價(jià)銀翹解毒丸的質(zhì)量提供了一定的研究基礎(chǔ)。

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