羅 曼, 周 蘭, 申 璀, 熊慧林
(貴州省食品藥品檢驗(yàn)所,貴州貴陽550004)
銀翹解毒丸由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子 (炒)、桔梗、淡竹葉、甘草九味中藥組成,具有疏風(fēng)解表,清熱解毒的功能?,F(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)有:《中國藥典》2005年版一部、《中國藥典》2010年版一部、《衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十四冊、 《衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十九冊、國家藥品監(jiān)管局標(biāo)準(zhǔn) (試行)WS-564(Z-110)-2002、國家藥品監(jiān)管局標(biāo)準(zhǔn) (試行)YBZ27002005。各標(biāo)準(zhǔn)收載的檢測指標(biāo)有顯微特征鑒別、薄層色譜定性鑒別及高效液相色譜定量測定等?,F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載的每種檢測指標(biāo)針對性強(qiáng),但覆蓋面有限,僅針對性地對方中1~2種藥味進(jìn)行檢測,由于銀翹解毒丸處方藥味較多,難以反映檢測樣品的全貌,有必要建立有效手段全面評價樣品質(zhì)量。中藥指紋圖譜及特征圖譜的研究應(yīng)用為更全面控制中成藥質(zhì)量提供了良好的研究前景,目前已有部分文獻(xiàn)報(bào)道采用指紋圖譜及特征圖譜探索成藥質(zhì)量控制研究[1-5],但大部分指紋圖譜及特征圖譜的研究仍集中于單味藥材的質(zhì)量控制。銀翹解毒丸的研究報(bào)道主要為銀翹解毒丸定量測定研究[6-7]及處方中單味原料藥材的指紋圖譜及特征圖譜研究[8-11],尚無銀翹解毒丸制劑特征圖譜的研究報(bào)道。根據(jù)本品法定標(biāo)準(zhǔn)收載的處方與制法模擬制備銀翹解毒丸10批,采用HPLC方法探索建立銀翹解毒模擬丸的特征圖譜,研究特征圖譜中特征峰的歸屬,為有效評價銀翹解毒丸的質(zhì)量提供了一定的研究基礎(chǔ)。
Aglient 1260液相色譜儀,Aglient 1260 DAD VL檢測器,HP液相色譜工作站。甲醇為色譜純(Tedia company),水為重蒸餾水,其余試劑均為分析純。參照物綠原酸 (中國藥品生物制品檢定所:110753-200413)、連翹苷 (中國藥品生物制品檢定所:110821-200609)、牛蒡苷 (中國藥品生物制品檢定所:110819-200505)。
處方中九味藥材各10批分別來源于廣西、江西、江蘇、貴州、浙江、內(nèi)蒙、湖南、陜西、河北、四川、甘肅、陜西、河南、吉林、山東、山西、新疆等地,經(jīng)本所中藥室熊慧林及貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定均符合2010年版《中國藥典》一部[12]要求。按銀翹解毒丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的處方與制法制備模擬丸劑10批,編號分別為WJ1~WJ10。
市售商品銀翹解毒丸5批,為四川省宜賓五糧液集團(tuán)宜賓制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品2批 (批號1008021,采樣地點(diǎn)四川;批號1008011,采樣地點(diǎn)四川),北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司產(chǎn)品3批(批號0035965,采樣地點(diǎn)山西;批號0035967,采樣地點(diǎn)遼寧;批號1036303采樣地點(diǎn)河北)。
2.1 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱 (4.6 mm ×250 mm);檢測波長279 nm,柱溫30℃;甲醇為流動相A,0.2%磷酸為流動相B,進(jìn)行線性梯度洗脫,0~10 min,A由10%線性改變至20%,10~30 min,A線性改變至30%,30~50 min,A線性改變至37%,50~80 min,A線性改變至50%;檢測波長279 nm;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸計(jì)不低于5000。
2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品0.01973 g,置100 mL量瓶,加甲醇溶解稀釋至刻度;連翹苷對照品0.01362 g,置50 mL量瓶,加甲醇溶解稀釋至刻度;牛蒡苷對照品0.01058 g,置50 mL量瓶,加甲醇溶解稀釋至刻度;分別量取上述綠原酸對照品溶液2 mL,連翹苷對照品溶液1 mL,牛蒡苷對照品溶液5 mL,置同一10 mL量瓶,加甲醇溶解稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液 (每1 mL各含綠原酸、連翹苷、牛蒡苷分別為 39.46 μg、27.24 μg 、105.8 μg)。對照品色譜圖見圖1。
圖1 混合對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the reference substances
2.3 供試品液制備 取模擬丸劑,研細(xì),取約4.5 g,精密稱定,置具塞錐瓶中,精密加入甲醇25 mL,超聲處理 (功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。樣品色譜圖見圖2。
圖2 銀翹解毒丸對照特征圖譜Fig.2 Standard chromatogram of simulated Yinqiao Jiedu Pills
2.4 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品 (重復(fù)性1)溶液各10 μL,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,按2.1項(xiàng)下條件檢測,采用中藥色譜指紋圖譜的相似性計(jì)算軟件對6次測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算,其相似度均為0.99以上,以綠原酸峰為對照峰,各共有峰的相對保留時間RSD值為0~0.07%,其相對峰面積的RSD值為0~0.98%,結(jié)果表明儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好,符合指紋圖譜的要求。
2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的供試品 (模擬丸一)共6份,精密稱定,按2.3項(xiàng)下制備,按2.1項(xiàng)色譜條件檢測,6次測定的圖譜其相似度均為0.99以上,以綠原酸為對照,各共有峰的相對保留時間RSD值為0~0.08%,其相對峰面積的RSD值為0~2.98%,結(jié)果表明同一批次的6份供試品色譜特征圖譜相似,沒有明顯的差異,方法的重復(fù)性良好,符合特征圖譜的要求。
2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.5項(xiàng)下同一供試品溶液,分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)行檢測,獲得不同時間進(jìn)樣的供試品色譜其相似度均為0.99以上,各共有峰的相對保留時間RSD值為0~0.06%,相對峰面積的RSD值為0~3.15%。結(jié)果表明,在24 h內(nèi)銀翹解毒模擬丸的特征圖譜基本穩(wěn)定,沒有明顯的變化,符合特征圖譜的要求。
2.7 銀翹解毒丸樣品標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的建立 比較10批模擬丸供試品溶液譜圖的相關(guān)參數(shù),結(jié)合重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)考查結(jié)果,刪除10批樣品色譜中平均相對峰面積小于0.03的色譜峰、重復(fù)性試驗(yàn)及穩(wěn)定性試驗(yàn)中相對保留時間及相對峰面積RSD大于5%的色譜峰以及峰形不佳的色譜峰,發(fā)現(xiàn)色譜圖中14個峰 (包含S峰在內(nèi))為各批供試品共有,且符合特征圖譜方法考查的要求,因此確定這14個峰為其共有峰。綠原酸峰最大,選作為S峰,11號峰為連翹苷,13號峰為牛蒡苷 (見圖3)。10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜共有峰的相對保留時間較一致,RSD為0~0.10%。10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜共有峰的相對峰面積差異較大,RSD為0~99.44%。銀翹解毒丸樣品標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜應(yīng)以相對保留時間為指標(biāo)建立,根據(jù)上述數(shù)據(jù)建立相應(yīng)的銀翹解毒丸的特征圖譜。10批銀翹解毒丸特征圖譜與標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜相似度在0.9以上 (見表1)。
2.8 銀翹解毒丸樣品特征圖譜特征峰歸屬 按照銀翹解毒丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的制法,制備分別缺失金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子(炒)、桔梗、淡竹葉、甘草等九味藥材的模擬陰性樣品。取上述9種陰性樣品,精密稱定,按2.3項(xiàng)下制備,按2.1項(xiàng)下條件檢測,將生成的陰性樣品圖譜與銀翹解毒丸樣品標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜進(jìn)行比較,確定特征峰的歸屬。經(jīng)圖譜比較,甘草、金銀花、連翹、牛蒡子4味藥材有明顯歸屬的色譜峰,分別為由5號,6號峰及其周圍1~3個小峰形成的組峰 (甘草)、S峰 (金銀花)、11號峰 (牛蒡子)、13號峰 (連翹)。如圖4,圖中GC-YX為缺甘草陰性樣品;GC為甘草;TYH-YX為缺金銀花陰性;LYS為綠原酸;NBZ-YX為缺牛蒡子陰性;NBG為牛蒡苷;LQ-YX為缺連翹陰性;LQG為連翹苷;YQJDW為銀翹解毒丸。
圖3 10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜Fig.3 Common chromatograms of ten batches of simulated Yinqiao Jiedu Pills
表1 銀翹解毒模擬丸樣品的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜相似度Tab.1 Similarity of simulated Yinqiao Jiedu Pills
2.9 樣品檢測評價 根據(jù)銀翹解毒模擬丸特征圖譜特征峰的歸屬,評價銀翹解毒丸??紤]到原料藥材產(chǎn)地、采收時間、貯存條件以及生產(chǎn)工藝參數(shù)的差異,兼顧特征圖譜適用性,僅評價抽驗(yàn)樣品色譜圖中是否檢出2.8項(xiàng)中所述特征峰:5、6號峰及其周圍的1~2個小峰形成的組峰中的任一色譜峰(甘草)、S峰 (金銀花)、11號峰 (牛蒡子)、13號峰 (連翹)。經(jīng)考查特征圖譜重復(fù)性、穩(wěn)定性的相對保留時間和10批模擬丸劑的相對保留時間離散度很小,RSD均小于2%,故規(guī)定特征峰相對保留時間限度為±2%。根據(jù)10批次模擬丸特征圖譜特征峰的相對峰面積分布,綜合考慮樣品生產(chǎn)中多重因素的影響,確定除S峰外的特征峰的豐度最低不小于10批次模擬丸劑中相對峰面積均值的50%。
限度范圍為:應(yīng)檢出S峰 (金銀花),5號峰(甘草組峰)~6號 (甘草組峰)的相對保留時間區(qū)間內(nèi) [1.827× (1±0.02)~1.861× (1±0.02)]至少一個相對峰面積不低于0.02的色譜峰,11號峰 (牛蒡子)相對保留時間為2.942×(1±0.02)且相對峰面積不低于0.2的色譜峰,13號峰 (連翹)為相對保留時間3.242×(1±0.02)且相對峰面積不低于0.04的色譜峰。
圖4 銀翹解毒丸特征圖譜特征峰定位Fig.4 Locating common chromatograms of Yinqiao Jiedu Pills
按本實(shí)驗(yàn)特征圖譜檢測法,測定市售銀翹解毒丸5批,均檢出金銀花、甘草、牛蒡子、連翹的特征峰,如圖5。
圖5 市售銀翹解毒丸特征圖譜Fig.5 Common chromatograms of Yinqiao Jiedu Pills in market
3.1 本實(shí)驗(yàn)選擇對共有特征峰中最大的色譜峰綠原酸峰作指標(biāo)考查樣品的提取時間,以甲醇超聲處理30 min的測定值最高,增加提取時間,測定值不再增加,從而確定樣品提取方法為甲醇超聲處理30 min。
3.2 本實(shí)驗(yàn)探索考查了特征圖譜的色譜系統(tǒng)及檢測波長。研究中嘗試了乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)的梯度洗脫,發(fā)現(xiàn)色譜峰保留時間不夠穩(wěn)定,色譜圖變化較大。甲醇-0.2%磷酸系統(tǒng)較穩(wěn)定,但不同梯度洗脫結(jié)果存在較大差異,經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定本實(shí)驗(yàn)所述的流動相梯度分離效果及色譜峰形最佳。檢測波長比較了230、240、260、270、279、320 nm,發(fā)現(xiàn)279 nm波長處檢測特征色譜峰較多,各特征色譜峰相對保留時間穩(wěn)定,雜質(zhì)干擾較少,故確定279 nm為檢測波長。
3.3 中藥特征圖譜技術(shù)是目前公認(rèn)的鑒別中藥品種和評價中藥質(zhì)量的有效手段,其優(yōu)點(diǎn)在于可全面反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分及其相對比例,在有效成分尚未完全闡明的情況下,可有效地表征中藥質(zhì)量。中藥色譜特征圖譜是一種綜合的,可量化的鑒別手段,是符合中藥特色的質(zhì)量控制模式之一[13]。本實(shí)驗(yàn)建立了銀翹解毒丸劑特征圖譜檢測方法,由于本品組方較為復(fù)雜由九味藥材組成,10批模擬丸中的九味藥材皆來源不同 (產(chǎn)地或批次不同),10批銀翹解毒丸劑特征圖譜共有14個共有特征峰,綠原酸峰最大,選作為S峰,牛蒡苷、連翹苷分別為樣品的11號、13號共有特征峰。從結(jié)果分析,多數(shù)的商品藥材化學(xué)成分相對穩(wěn)定,質(zhì)量較高,相似度均大于0.9。由于藥材為天然產(chǎn)物,樣品的理化成分為其在自然界產(chǎn)生的代謝物質(zhì),其量的高低受產(chǎn)地、氣候、采收季節(jié)等因素的影響而不同,對于成藥而言影響因素還有生產(chǎn)過程中工藝參數(shù)的控制、運(yùn)輸及儲存等的影響。樣品中的理化成分種類的數(shù)量則相對穩(wěn)定,僅每種物質(zhì)的含有量或相對豐度存在差異?;谏鲜隹紤],本實(shí)驗(yàn)考察了10批次的模擬丸,運(yùn)用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件分析,評價模擬丸劑圖譜與10批模擬丸劑生成的標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的相似性,其相似度在0.85以上。10批樣品中相對保留時間的離散度很小,14個共有特征峰的相對保留時間的RSD均在0.11%以下。10批樣品中相對峰面積的離散度較大,14個共有特征峰的相對峰面積的RSD最高可達(dá)99.44%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品中的理化成分種類相對穩(wěn)定,而理化成分的量受多因素的影響存在較大的變化。
3.4 考慮到銀翹解毒丸批準(zhǔn)文號較多,全國大部分地區(qū)均有生產(chǎn)企業(yè),不同地域生產(chǎn)企業(yè)投料用原料藥材可能存在較大差異如產(chǎn)地及批次等,很難確定一個極具代表性的產(chǎn)品?;谏鲜鲈?,本實(shí)驗(yàn)從全國各地收集經(jīng)鑒定符合2010年版《中國藥典》一部要求的九味原料藥材各10批,按法定標(biāo)準(zhǔn)的處方及制法自制銀翹解毒丸作為特征圖譜的探索性研究的試驗(yàn)對象。本實(shí)驗(yàn)中模擬丸為試驗(yàn)室小試樣品與企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)存在差異,兩者特征性的差異有待進(jìn)一步研究。但作為多指標(biāo)定性質(zhì)量控制方法的建立,本實(shí)驗(yàn)研究具有一定的研究意義,實(shí)驗(yàn)建立的特征圖譜,專屬性強(qiáng),重復(fù)性好,可有效地鑒別和評價銀翹解毒丸的質(zhì)量優(yōu)劣,為全面評價銀翹解毒丸的質(zhì)量提供了一定的研究基礎(chǔ)。
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