張艷麗 ，姚樹坤 ★，劉俊寶

（1.中日友好醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100029，2.北京朝陽三環(huán)腫瘤醫(yī)院，北京 100122）

十二指腸胃反流（duodenogastric reflux，DGR）可直接造成胃黏膜損傷，嚴(yán)重者造成膽汁反流性胃炎甚至誘發(fā)細(xì)胞癌變[1，2]。十二指腸反流液由膽汁、胰液和十二指腸液組成，哪種成分導(dǎo)致黏膜炎癥，還是多種成分協(xié)同作用加重黏膜損傷，目前機(jī)制尚不明確。我們成功引流SD大鼠的膽汁或十二指腸混合液（包括膽汁+胰液+十二指腸液），再將引流液灌胃建立SD大鼠DGR模型，觀察胃黏膜病理改變、細(xì)胞因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的規(guī)律，為闡明DRG胃黏膜損傷機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

手術(shù)組包括成年SD大鼠16只，體質(zhì)量200～250g，雌雄各半，隨機(jī)分為引流膽汁組（n=8）和引流十二指腸混合液組（n=8）。前組進(jìn)行肝總管插管手術(shù)，后組進(jìn)行十二指腸插管手術(shù)，術(shù)后分別制備并收集膽汁和十二指腸混合液 （包括膽汁+胰液+十二指腸液）。此外成年SD大鼠24只，體質(zhì)量200～250g，雌雄各半；隨機(jī)分成 A、B和 C組，各8只。A組行膽汁灌胃造模，B組行十二指腸混合液灌胃造模，C組行生理鹽水灌胃。所有大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物等級Ⅱ級，合格證編號DK0407-0049。

1.2 造模方法

1.2.1 膽汁或十二指腸混合液的制備和收集

①膽汁的收集和制備：SD大鼠術(shù)前禁食24h不禁水，2%戊巴比妥鈉0.2ml/100g腹腔注射麻醉，局部碘伏消毒，取劍突下及腹中線作約3cm的切口切腹，翻起肝臟后，在門靜脈一側(cè)看到1根黃色透明的管道即肝總管，分離肝總管，在其壁剪一小口，插入聚乙烯管，可見黃色的膽汁流出，導(dǎo)管結(jié)扎固定。肝腸復(fù)位，關(guān)腹前腹腔內(nèi)注入溫生理鹽水1ml，逐層縫合腹膜、肌層和皮膚，引流管末端插入10ml塑料離心管內(nèi)收集膽汁，收集導(dǎo)管固定在動物背部。②十二指腸混合液的收集和制備：SD大鼠的準(zhǔn)備、麻醉和切腹過程同上，翻起肝臟后，找到胃幽門與十二指腸交界處，在十二指腸距幽門約1cm處剪口，插入聚乙烯管引流胃液，結(jié)扎十二指腸上端，固定及縫合。在十二指腸遠(yuǎn)端10cm處的腸壁上剪口，此處插入2根聚乙烯管，一根引流膽汁+胰液+十二指腸液，另一根定時定量（2ml/4h）注入葡萄糖-鹽水及純牛奶，以維持大鼠生命活動。導(dǎo)管均結(jié)扎固定。肝腸復(fù)位、關(guān)腹、收集導(dǎo)管固定方法均同前。將收集到的膽汁和十二指腸混合液分別保存于小塑料管，置于-20℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.2.2 DGR動物模型的建立

將收集的膽汁和十二指腸混合液分別給A組和B組大鼠灌胃，制備不同DGR模型，自灌胃前1d起，每天18：00供大鼠標(biāo)準(zhǔn)鼠料15g/只，正常飲水。 每天 8：30、11：30、14：30 和 17：30 按照0.3ml/100g體重給大鼠灌胃，共14d。C組為對照組大鼠，給予同等量生理鹽水灌胃。

1.3 主要試劑

細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，一抗TNF-α、抗IL-1β和抗IL-4，生物素標(biāo)記的二抗IgG工作液，SP試劑盒及DAB顯色劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司（Santa cruze公司產(chǎn)品）。

1.4 實驗方法

1.4.1 引流液的pH值、總膽汁酸、胰淀粉酶測定

各取膽汁引流液和十二指腸引流液10ml，用pH監(jiān)測儀測值；再分別各取2ml采用免疫熒光法測定總膽汁酸、胰淀粉酶的含量。

1.4.2 標(biāo)本的處理

3組大鼠均灌胃14d，d15斷頭方法處死大鼠。剖腹取胃，自幽門向上剪開胃，肉眼觀察大體病理改變，遂將胃分割為胃底、胃體和胃幽門三部分，每部分標(biāo)本置于福爾馬林內(nèi)固定，石蠟包埋，做厚5μm連續(xù)切片，分別用于：HE染色光學(xué)顯微鏡觀察、免疫組織化學(xué)研究和細(xì)胞凋亡檢測。

1.4.3 胃黏膜病理觀察

石蠟切片脫蠟后，行蘇木素-伊紅染色（HE染色），在光學(xué)顯微鏡下，進(jìn)行低倍和高倍鏡下觀察。

1.4.4 免疫組化法觀察TNF-α、IL-1β和IL-4的表達(dá)

主要步驟如下：石蠟切片脫蠟至水；3%甲醛-雙氧水室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；抗原修復(fù)時滴加10%正常山羊血清封閉游離的結(jié)合位點，滴加PBS緩沖液1：100稀釋的一抗（分別為抗TNF-α、抗IL-1β和抗IL-4的抗體），4℃冰箱過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗IgG工作液 （羊抗鼠），37℃孵育 30min；DAB顯色；復(fù)染；酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照用PBS替代一抗，其余步驟同上。

結(jié)果判定：所有標(biāo)本均在Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)內(nèi)在相同的放大倍數(shù)下觀察，TNF-α、IL-1β和IL-4在胃黏膜組織上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，呈棕黃色或黃色，即陽性表達(dá)。參照El-Assal[3]及Ohmori[4]描述的方法計算TNF-α、IL-1β 和 IL-4 的表達(dá)指數(shù)（expression index，EI），即陽性目標(biāo)平均光密度×陽性目標(biāo)面密度×100%，其中陽性目標(biāo)平均光密度為抗原表達(dá)的強(qiáng)度，在監(jiān)視器上越亮，染色越深；陽性目標(biāo)面密度表示陽性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計場面積，值越大陽性目標(biāo)占的比例越大。

1.4.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

大鼠胃黏膜組織切片常規(guī)脫蠟至水。用蛋白酶K室溫孵育15～30min后，加TUNEL反應(yīng)混合溶液標(biāo)記，在濕盒中孵育60min。信號轉(zhuǎn)化和分析，擦干樣品周圍的水分，加入50μl轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中37℃孵育30min。PBS沖洗3次，加入50～100μl DAB底物溶液，室溫孵育10min，PBS沖洗3次。封片后在光鏡下分析結(jié)果。

結(jié)果判定：所有標(biāo)本均在Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)內(nèi)在相同的放大倍數(shù)下觀察，細(xì)胞核內(nèi)有棕色或棕褐色顆粒彌漫分布者為陽性凋亡細(xì)胞[5]。每張切片觀察500個以上胃黏膜上皮細(xì)胞，計算每100個上皮細(xì)胞中陽性凋亡細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS12.0軟件。組間比較采用單因素方差分析，計量資料比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)組大鼠引流液pH值、總膽汁酸及胰淀粉酶測定

膽汁引流組的pH值低于十二指腸混合液引流組（6.9 vs 7.8，P＞0.05），膽汁引流組的總膽汁酸明顯高于十二指腸混合液引流組 （477.9±44.71μmol/L vs 329.6±60.31μmol/L，P＜0.05），膽汁引流組未檢測到胰淀粉酶，而十二指腸混合液中胰淀粉酶測定為8784.4±1825.63U/L。

2.2 光鏡下形態(tài)觀察

C組大鼠的胃黏膜組織未見明顯異常。DGR模型大鼠A組和B組胃黏膜均可見不同程度的炎性改變，主要限于黏膜淺層，呈彌漫性或灶狀分布。胃黏膜炎細(xì)胞浸潤主要淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，也可見少量嗜酸性粒細(xì)胞。此外可見固有膜平滑肌纖維和胃小凹增生。A組和B組均造模成功，但兩組的胃黏膜病理學(xué)改變無明顯差異。

2.3 大鼠胃黏膜細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-4的表達(dá)

TNF-α主要表達(dá)于胃腺頸部及底部細(xì)胞漿中，呈黃色或棕黃色。IL-1β表達(dá)主要在胃腺頸部及底部細(xì)胞漿中表達(dá)，呈黃色或棕黃色。IL-4表達(dá)主要表達(dá)于胃腺頸部及底部的細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，呈黃色或棕黃色。表1示，A組和B組的TNF-α、IL-1β的EI均顯著高于C組（均P＜0.05）。3組間的IL-4的EI比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞因子表達(dá)的比較（±s）（n=8）

表1 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞因子表達(dá)的比較（±s）（n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

EI A組（DGR模型） B組（DGR模型） C組（對照）TNF-α 2.08±1.40* 1.95±1.01* 0.75±0.39 IL-1β 2.72±0.40* 2.77±0.99* 1.15±0.50 IL-4 2.36±0.04 2.76±0.01 2.26±0.89

2.4 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況

C組大鼠胃黏膜凋亡細(xì)胞主要位于胃底腺頸部表面，呈單個散在分布。A組和B組的大鼠胃黏膜凋亡細(xì)胞在黏膜全層均可見，主要位于胃底腺頸部，分布密集，形成凋亡細(xì)胞帶。凋亡細(xì)胞呈棕褐色，體積小，形態(tài)呈濃縮或碎點狀，不規(guī)則，大小不一致，周圍無炎癥反應(yīng)。非凋亡細(xì)胞被蘇木素復(fù)染成藍(lán)色，核較大，形態(tài)大小較為一致。A、B和C 組的 AI分別為 16.29±4.87、16.62±4.71 和 3.45±2.21，其中A組和B組的AI均顯著高于對照組（P＜0.05），而 A、B 組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討論

以往的實驗研究中DGR動物模型多采用胃空腸吻合術(shù)使十二指腸液反流入胃內(nèi)[6]，但解剖學(xué)的改變不能模擬人類的原發(fā)性DGR。而本研究成功地將細(xì)聚乙烯管插入大鼠的肝總管和十二指腸，分別引流出膽汁或膽汁+胰液+十二指腸液的混合物，再進(jìn)行灌胃制成DGR模型。胃黏膜病理顯示不同程度的炎性改變，提示造模成功。此原發(fā)性DGR大鼠模型的優(yōu)點是：簡單易行，保證了胃十二指腸解剖結(jié)構(gòu)的完整性，很好地模擬人類原發(fā)性DGR的發(fā)病過程。

十二指腸胃反流液的主要成分和主要致病因素是膽酸鹽成分，但目前公認(rèn)的觀點是膽汁+胰液+十二指腸液的黏膜損傷作用比單獨膽汁損傷作用更大[7]。本研究中膽汁和十二指腸混合液分別灌胃所致胃黏膜炎癥無明顯差異，該結(jié)果與以往結(jié)論不一致，可能與本實驗灌胃造模時間短、灌胃的引流液量較少有關(guān)。

以往的研究發(fā)現(xiàn)致炎性細(xì)胞因子和抑炎性細(xì)胞因子在慢性胃炎的發(fā)病中起到重要作用。其中TNF-α和IL-1β是2種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，尤其是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)[8]。很多研究顯示，慢性胃炎的發(fā)生與TNF-α和IL-1β在胃黏膜組織的高表達(dá)密不可分[9]。TNF-α誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附及白細(xì)胞穿出血管壁，造成黏膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時還可促進(jìn)其他細(xì)胞因子的大量釋放，進(jìn)一步引起中性粒細(xì)胞活化、急性期蛋白生成和小血管內(nèi)凝血，影響?zhàn)つぱ豕?yīng)，加重黏膜損害。而IL-1同樣可促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示DGR模型組的TNF-α和IL-1β表達(dá)明顯高于對照組，進(jìn)一步提示該細(xì)胞因子參與了DGR胃黏膜損傷過程。另外，IL-4作為一種抑炎性細(xì)胞因子，在DGR模型組和對照組的胃黏膜表達(dá)無明顯差別。由此推斷DGR胃黏膜損傷過程中可能有致炎性細(xì)胞因子和抑炎性細(xì)胞因子的共同參與，最后導(dǎo)致黏膜損傷進(jìn)行性加重。

很多研究顯示多種細(xì)胞因子對細(xì)胞的凋亡起調(diào)控作用。目前TNF-α對細(xì)胞的誘導(dǎo)作用已得到公認(rèn)，可能是通過與靶細(xì)胞膜上特異性受體（TNFR）結(jié)合，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的一系列信號通路，從而影響細(xì)胞凋亡[10]。而且近年來也有學(xué)者開始關(guān)注細(xì)胞凋亡在胃黏膜損傷過程中的作用[11]。本研究中，我們利用TUNEL法檢測胃黏膜細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組的細(xì)胞凋亡主要在黏膜表層散在分布，而DGR模型組呈連續(xù)分布或成堆出現(xiàn)，A組和B組的凋亡指數(shù)均明顯高于對照組 （P＜0.05）。細(xì)胞凋亡的增加可導(dǎo)致胃黏膜的萎縮，可能是萎縮性胃炎發(fā)生的原因之一。另外，胃黏膜上皮細(xì)胞大量凋亡時，可能會有代償性增殖加快，如果致凋亡因素長期慢性作用，細(xì)胞增殖過度而出現(xiàn)異常增殖甚至細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程，那么細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)節(jié)紊亂可能是十二指腸胃反流造成胃黏膜損傷乃至細(xì)胞癌變的發(fā)病機(jī)制之一。

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