張海峰，張 穎，任青愛，謝曉華

（解放軍總醫(yī)院 南樓外一科，北京 100853）

當機體受到嚴重創(chuàng)傷、手術、休克等打擊時，會產生一系列應激反應，導致機體損傷，肺臟、心臟等遠隔臟器的損害常較為嚴重。研究發(fā)現[1]：大鼠截肢創(chuàng)傷可造成肺損傷，術后6h肺損傷最重。研究已證實：缺血缺氧是導致各種臟器損害的主要始動因素之一，線粒體損害是缺血缺氧損害的關鍵環(huán)節(jié)，創(chuàng)傷引起的缺血缺氧等原因導致線粒體結構和功能的損傷可能是創(chuàng)傷后肺臟等遠隔臟器損害的重要環(huán)節(jié)。本實驗旨在研究截肢創(chuàng)傷后大鼠肺組織細胞內線粒體結構與功能的損傷情況及他克莫司（tacrolimus，FK506）對其的干預及作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

生物氧耗分析系統(tǒng)（Strathkelvin，英國）、多功能酶標儀 SynergyHT（Bio-TEK，美國）；熒光分光光度計 Hitachi-2500（日立，日本）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 （碧云天生物技術研究所）；總ATP酶活力測定試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；Rhodamine 123、ADP（Sigma，美國）。

1.2 實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠24只，體重260～300g，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，常規(guī)條件下標準飼料喂養(yǎng)。隨機分為3組（n=8）。對照組：腹腔注射與干預組等體積的生理鹽水，6h后麻醉迅速處死；創(chuàng)傷組：以截肢創(chuàng)傷應激后6h大鼠作為創(chuàng)傷對照，創(chuàng)傷后立即腹腔注射與干預組等體積的生理鹽水，截肢術后6h迅速處死；干預組：截肢后立即腹腔注射FK506 0.1mg/kg[2]，截肢術后6h迅速處死。

1.3 動物模型制作及標本采集

3%異戊巴比妥鈉（80mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定。先于左側腹股溝處切開皮膚，游離出股動靜脈，結扎腹壁淺動靜脈及其他分支，于膝關節(jié)上方1.2～1.4cm處完全切斷除股靜、動脈以外的所有結構，縫扎止血，最后剪斷股靜、動脈，建立大鼠左后肢的截肢創(chuàng)傷應激模型。6h后將大鼠斷頭處死，立即解剖取出肺臟。取肺臟組織約1g，置于帶冰碴生理鹽水中清洗殘存血液，參照STE溶液分離法[3]提取分離肺臟線粒體：按1g組織+9ml分離介質比例加入0～4℃的線粒體分離介質 （250ml反應體系中加入蔗糖 21.935g、Tris 0.3025g、EDTA 0.073g， 用 Tris-HCl調節(jié) pH 至7.5），組織剪碎后勻漿、離心、取上清，收集的上清液于2℃下11500g離心15min，棄上清，用適量（2～3ml）分離介質懸浮，重復離心 1次，最后將沉淀用分離介質懸浮制成線粒體混懸液。以上操作均在0～4℃下進行，1h內完成。

1.4 指標檢測

1.4.1 線粒體呼吸功能測定

采用strathkelvin氧電極法測定線粒體呼吸功能，測定參照盧國守等[4]的方法?？偡磻w積為800μl，反應溫度30℃。 預先加入 700μl反應介質（甘 露 醇 225mmol/L、 蔗 糖 75mmol/L、KH2PO45mmol/L、Tris 10mmol/L、K+-EDTA 0.05mmol/L、KCl 5mmol/L，pH7.4）孵育 2min，以空氣飽和，然后加入線粒體懸液100μl，預溫1～2min后依次加入反應底物谷氨酸鈉 （1.25mol/L）和蘋果酸鈉（1.25mol/L） 各 10μl， 間 隔 約 1min， 后 加 入40mmol/L的ADP 2μl，觀察線粒體呼吸態(tài)的變化，記錄氧耗曲線，計算在ADP加入后3態(tài)呼吸（ST3）和 ADP耗盡后 4態(tài)呼吸（ST4）的氧耗量，呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）以 3、4 態(tài)耗氧之比（ST3/ST4）表示。

1.4.2 線粒體膜電位測定

按Ronald等[5]的方法進行。反應介質為蔗糖150mmol/L、氯化鎂 5mmol/L、琥珀酸鈉 5mmol/L、魚滕酮2.5mmol/L、磷酸鉀緩沖液5mmol/L、Rhodamine123 1μmol/L、Hepes 20mmol/L，pH7.4。取線粒體懸液100μl，加反應介質1ml，室溫下反應5min，然后5000g離心5min，取上清于500nm處比色測線粒體外Rhodamine123濃度（Xout）。設定線粒體基質體積1μl/mg蛋白，線粒體內Rhodamine123 濃度 Xin=（1-1.1×Xout）×10000/蛋白濃度，線粒體膜電位 MMP=59×lgXin/Xout。

1.4.3 線粒體總ATP酶活力測定

ATP酶可分解ATP生成ADP及無機磷，測定無機磷的含量可判斷ATP酶活性的高低。定義每小時每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為 1個 ATP酶活力單位［μmolPi/（mgprot·h）］。 嚴格按照 ATP 酶試劑盒說明書操作。

1.5 電鏡觀察

從創(chuàng)傷組、干預組中隨機留取1只大鼠肺組織約1mm×1mm×1mm，立即置于 2.5%戊二醛（磷酸緩沖液配制）中4℃固定1～2h，PBS洗3次，反復換液，1%鋨酸固定。送電鏡室浸潤包埋，制作超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS15軟件進行方差齊性檢驗、成組資料采用t檢驗。

2 結果

2.1 肺線粒體呼吸功能的變化

與對照組比較，創(chuàng)傷組肺線粒體ST3耗氧量、RCR、膜電位及總ATP酶活力顯著降低 （P＜0.05），ST4耗氧量有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與創(chuàng)傷組比較，干預組線粒體ST3耗氧量、RCR、膜電位及總ATP酶活力顯著升高（P＜0.05），ST4耗氧量有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05） （表 1）。

表1 各組大鼠肺線粒體呼吸功能指標的變化（±s，n=8）

表1 各組大鼠肺線粒體呼吸功能指標的變化（±s，n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與創(chuàng)傷組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 電鏡觀察

創(chuàng)傷后6h肺線粒體膜結構不清晰，線粒體明顯腫脹，部分線粒體出現空泡、嵴減少、斷裂、結構不清（圖1A）。加用FK506后肺線粒體腫脹及內部結構損傷見輕度腫脹，程度比創(chuàng)傷組有所減輕（圖 1B）。

圖1 大鼠肺細胞線粒體形態(tài)的透射電鏡觀察

3 討論

線粒體對于維持細胞的正常功能具有十分重要的作用。研究表明，線粒體功能異常是細胞損害的關鍵環(huán)節(jié)[6]。線粒體呼吸功能ST3代表ADP對線粒體氧化磷酸化功能的刺激效應，ST4反映質子漏狀況，RCR反映線粒體結構完整性及氧化磷酸化耦聯程度；而線粒體膜電位直接反映線粒體功能[7]，線粒體其正常功能依賴于膜結構的高度完整性，線粒體能量代謝障礙會引起膜電位的下降[8]。ATP酶存在于組織細胞及細胞器的膜上，線粒體膜上的ATP酶是調節(jié)和維持細胞和線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的關鍵因素。

本實驗結果顯示：截肢創(chuàng)傷導致了大鼠肺線粒體結構和功能的損傷，這可能是創(chuàng)傷后肺損害的重要環(huán)節(jié)。這一變化可能的機制是：①氧自由基生成過量。氧自由基能夠影響線粒體呼吸鏈復合物的活力，其生成過量可通過影響線粒體的氧化磷酸化而降低細胞內ATP的合成[9]。②Ca2+超載。當Ca2+攝入過量時，促使內膜小孔開放，引起線粒體膜電位降低和氧化磷酸化的脫耦聯[10]。在心肌細胞和神經細胞的研究中顯示[11，12]：缺血后由于線粒體能量代謝障礙，導致線粒體發(fā)生腫脹；同時線粒體細胞質內Ca2+的重攝取能力下降，導致線粒體呼吸功能障礙。③線粒體通透性轉換孔的高通透狀態(tài)即所謂的線粒體通透性轉換（mitochondrial permeability transition，MPT）， 它與細胞死亡調節(jié)有關。當發(fā)生MPT時，線粒體允許分子量＜5000Da的物質自由進出，Ca2+全部釋放，膜電位完全、永久消失，線粒體腫脹，它受Ca2+、ADP、氧化應激及高PH誘導[10]。

鈣調蛋白（CaN）介導的信號通路參與血管平滑肌細胞增殖和內皮細胞功能的調節(jié)，在細胞凋亡的調節(jié)中也起重要作用。Sayen等[13]發(fā)現在CaN轉基因小鼠模型中，CaN信號通路影響了心肌線粒體的能量代謝。另有研究發(fā)現：CaN抑制劑FK506預處理可以保護心肌、肝、腎受損線粒體的呼吸功能[14，15]。本實驗結果提示FK506的應用可使肺線粒體功能明顯改善，說明CaN信號通路可能參與了截肢創(chuàng)傷應激后的肺線粒體損傷，FK506干預可部分改善肺線粒體的呼吸功能，對創(chuàng)傷應激后肺線粒體損傷具有保護作用。環(huán)孢素A （Cyclosporin A，CsA）是經典的通透性轉換孔（MPTP）抑制藥，可與親環(huán)蛋白 D（CyP-D）結合形成復合物，阻礙CyP-D與ANT的結合、抑制通道開放[16]。FK506是CsA的換代產品，可能通過相似機制抑制了通道的開放、發(fā)揮膜電位穩(wěn)定作用。

總之，截肢創(chuàng)傷可能通過炎性反應、缺血、缺氧、Ca2+超載等途徑和機制導致肺線粒體出現結構和功能的損傷，而FK506可能通過抑制CaN信號通路、穩(wěn)定線粒體膜、提高線粒體氧化磷酸化耦聯程度、在一定程度上緩解能量供應的不足，減輕創(chuàng)傷后肺細胞線粒體的損傷，從而為進一步研究創(chuàng)傷后肺損傷的保護提供了實驗依據。

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