徐利民，陸永建，柳浩然

膠質(zhì)瘤是中樞系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。目前手術(shù)治療無(wú)法根治，常規(guī)的放療及化療效果均較差，臨床預(yù)后差?；|(zhì)金屬蛋白酶介導(dǎo)的組織內(nèi)基底膜的降解在腫瘤的生長(zhǎng)、血管形成、局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)鄰近的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，是促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)以EMMPRIN 基因?yàn)榘悬c(diǎn)治療腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討EMMPRIN 基因表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，轉(zhuǎn)染試劑LipofectameTM2000、Rabbit anti－EMMPRIN 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，RT－PCR 試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司，MTT 及PI 均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，siRNA－EMMPRIN 及陰性對(duì)照siRNA－negtive 購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)合成siRNA－EMMPRIN 及陰性對(duì)照siRNA－negtive 片段 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成的兩對(duì)siRNA－EMMPRIN 序列以及陰性對(duì)照siRNA－negtive 片段序列如下:

siRNA－negative control 序列，Sense:5－UUCUCCGAACGUGUCUTT－3;Antisense:5－ACGUGACACGUUCGGAGGATT－3。siRNA－EMMPRIN－1序列，Sense:5－GUUGAUGUGUUCUGACGAC dTdT－ 3;Antisense:5－GUCGUCAGAACACAUCAACTT－ 3。siRNA－EMMPRIN－2 序列，Sense:5－GACGUUCUUGCCUUUGUCA dTdT－3;Antisense:5－UGACAAAGGCAACGUCTT－3。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄酶－多聚酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)檢測(cè)EMMPRIN 基因mRNA 表達(dá)水平 本實(shí)驗(yàn)分為3組:siRNA－negative control 序列轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照組，siRNA－EMMPRIN－ 1 序列轉(zhuǎn)染組為實(shí)驗(yàn)組1，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列轉(zhuǎn)染組為實(shí)驗(yàn)組2，按Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取轉(zhuǎn)染48 h 后上述三組細(xì)胞的總RNA。RT－PCR 反應(yīng)參照RT－PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成，EMMPRIN 基因引物序列如下。

Forward primer:5'－CTCTGAGGACAAGGCCCTCATGAAC－3';Reverse primer:5'－CCGGCGCTTCTCGTAGATGAAGATG－3';擴(kuò)增片段長(zhǎng)度268 bp，Tm:60 ℃。

人內(nèi)參GAPDH 引物序列如下:Forward primer:5'－GCCACATCGCTCAGACAC－3';Reverse primer:5'－CATCACGCCACAGTTTCC－3';擴(kuò)增片段長(zhǎng)度614 bp，Tm:59 ℃。

PCR 反應(yīng)結(jié)束，取10 μl PCR 產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻，加入2% 的瓊脂糖凝膠梳孔行電泳。取DNA marker 進(jìn)行電泳，作為標(biāo)準(zhǔn)分子量的參照。80 V 恒定電壓下行電泳45 min 后，將凝膠電泳置入凝膠分析儀暗箱中拍攝凝膠電泳圖像。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)EMMPRIN 的表達(dá) 分別收集轉(zhuǎn)染后48 h 的siRNA－negative control 序列轉(zhuǎn)染組，siRNA－EMMPRIN－1 序列轉(zhuǎn)染組，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS漂洗3 次后加入200 μl 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，每個(gè)樣本有效超聲3 次后，加入5 ×SDS 凝膠加樣緩沖液，沸水浴5 min，每孔加樣20 μl 行12%十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用5%脫脂奶封閉1 h 加入一抗，4 ℃過(guò)夜，加入二抗室溫下孵育1 h，化學(xué)法發(fā)光，膠片顯色，分析結(jié)果。以tubulin 作為內(nèi)參照。

1.2.4 甲基噻唑基四唑法(MTT 法)檢測(cè)細(xì)胞增殖 U251 細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，以含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整濃度至(1 ～5)×105個(gè)/ml，取上述細(xì)胞懸液200 μl 至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h 后，進(jìn)行小分子干擾片段轉(zhuǎn)染，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板周?chē)?2 個(gè)孔舍棄，不加試劑。6 h 后更換10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，37°C，5%(v/v)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。分別于培養(yǎng)12、24、48 h 后，吸干培養(yǎng)液，以PBS 漂洗2 遍后，每個(gè)孔中加入5mg/ml 的MTT 20 μl，同樣條件下培養(yǎng)4 h 后吸干，可見(jiàn)黑色結(jié)晶，終止培養(yǎng)。再于每個(gè)孔中加入200 μl 的DMSO，避光振蕩溶解10 min，并設(shè)定空白對(duì)照孔，調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490nm 時(shí)各孔的吸光值(A490)。

1.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染48 h 后6 孔培養(yǎng)板中的siRNA－negative control 序列轉(zhuǎn)染組，siRNA－EMMPRIN－1 序列轉(zhuǎn)染組，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞至(1 ～5)×106個(gè)/ml。加入3 ml 預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，800 r/min ×5 min，吸凈上清。加入500μl PBS，輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞分離為單個(gè)，逐滴加入預(yù)冷的100%乙醇(－20℃)1.5 ml，使其終濃度為75%，－20 ℃放置過(guò)夜固定。取出固定樣本，800 r/min×5 min，棄上清。加入3 ml 預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，800 r/min×5 min，離心收集細(xì)胞，除去乙醇。加入150 μl RNaseA 重懸細(xì)胞，室溫靜置10 min，加入150 μl PI 工作液，4℃避光染色30 min。轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管:上機(jī)檢測(cè)，PI 用488 nm 氬離子激光器激發(fā)，由630 帶通濾光片接收，通過(guò)FSC/SSC 散點(diǎn)圖收集10 000 個(gè)細(xì)胞，采用設(shè)門(mén)技術(shù)排除粘連細(xì)胞和碎片，分析PI 熒光直方圖上細(xì)胞各周期及凋亡細(xì)胞的百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析處理。多組間比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMMPRIN－siRNA 小片段轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞后EMMPRIN 基因mRNA 及蛋白的表達(dá) 如圖1 與圖2 中結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染EMMPRIN－siRNA 小分子干擾片段后，相對(duì)于陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)組2 中U251 細(xì)胞EMMPRIN 基因的mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。

2.2 EMMPRIN 基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致U251 細(xì)胞增殖抑制 在轉(zhuǎn)染EMMPRIN－siRNA 小分子干擾片段12 h，24 h 及48 h 后，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 與陰性對(duì)照組相比細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P ＜0.05，表1)。

表1 各組U251 細(xì)胞MTT 檢測(cè)結(jié)果(n=5;±s)

表1 各組U251 細(xì)胞MTT 檢測(cè)結(jié)果(n=5;±s)

注:各時(shí)間點(diǎn)MTT 檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照組相比，①P ＜0.05

時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2 12 h0.1176±0.011 0.1061±0.008① 0.1022±0.013①24 h0.5913±0.009 0.3902±0.012① 0.3889±0.011①48 h0.8861±0.013 0.5838±0.011① 0.5756±0.012①

2.3 EMMPRIN 基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致U251 細(xì)胞凋亡增加 EMMPRIN－siRNA 轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞的凋亡率為(6.0 ±0.7)%，實(shí)驗(yàn)組2 細(xì)胞的凋亡率為(6.4 ±1.0)%，陰性對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為(2.7 ±0.6)%，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 細(xì)胞的凋亡率與陰性對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率相比明顯升高(P ＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 EMMPRIN 基因表達(dá)下調(diào)對(duì)U251 細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的影響 如前述方法將EMMPRIN－siRNA 小分子干擾片段轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行PI 染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示:EMMPRIN－siRNA 轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞，細(xì)胞的周期分布發(fā)生顯著變化，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 和陰性對(duì)照組細(xì)胞S 期細(xì)胞比例分別為(28.1 ±2.6)%，(29.1 ±2.9)%，(45.1 ±3.1)%，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 細(xì)胞的S 期細(xì)胞比例與陰性對(duì)照組細(xì)胞的S 期細(xì)胞比例相比明顯降低(P ＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

EMMPRIN 是免疫球蛋白超家族中的一個(gè)成員，正常時(shí)僅在有限的幾種細(xì)胞(上皮細(xì)胞、生殖細(xì)胞、左心室心肌細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞［1］)表達(dá)，而在腫瘤組織中廣泛的高表達(dá)。在正常生理?xiàng)l件下，EMMPRIN 參與創(chuàng)傷愈合、組織修復(fù)、妊娠和胚胎發(fā)育等眾多的生理過(guò)程。同時(shí)，EMMPRIN 基因表達(dá)對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤血管的形成和化療抵抗均起到重要作用。Sameshima 等［2］對(duì)人腦膠質(zhì)瘤與EMMRPIN 基因關(guān)系的研究顯示，與正常腦組織相比，EMMPRIN 基因在人腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度成正相關(guān)，EMMPRIN 基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生，發(fā)展過(guò)程中起重要的作用。

Zucker 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)轉(zhuǎn)染EMMPRIN 的cDNA 到乳腺癌細(xì)胞MDA－MB436 中后，細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖能力迅速提高，其機(jī)制在于EMMPRIN介導(dǎo)的MMP－2 和MMP－9 的生成，加速降解細(xì)胞外基質(zhì)而使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)加速。Han 等［4］通過(guò)RNA 干擾沉默人前列腺癌細(xì)胞和人膀胱癌細(xì)胞EMMPRIN 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)和增殖能力明顯降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)U251 細(xì)胞中EMMPRIN 的表達(dá)能夠有效抑制細(xì)胞的增殖，首次證實(shí)了EMMPRIN 基因在膠質(zhì)瘤中也是起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，與在其他惡性腫瘤中作用一致。筆者通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)下調(diào)U251 細(xì)胞中EMMPRIN 基因的表達(dá)使細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，S 期細(xì)胞比例顯著減少，使細(xì)胞有絲分裂減少，從而抑制細(xì)胞的增殖。這說(shuō)明下調(diào)EMMPRIN 基因的表達(dá)可能是通過(guò)影響細(xì)胞有絲分裂從而抑制細(xì)胞增殖。Tang 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN 在乳腺癌中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制在于EMMPRIN 介導(dǎo)的MMP－2 和MMP－9 的生成，加速降解細(xì)胞外基質(zhì)而使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)加速。Baba等［6］研究證實(shí)，通過(guò)抑制EMMPRIN 的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝，從而抑制腫瘤的增殖。Xiang等［7］的研究證實(shí)，EMMPRIN 基因表達(dá)下調(diào)能夠有效抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞在體外和裸鼠體內(nèi)的增殖，認(rèn)為可能的機(jī)制是EMMPRIN 基因表達(dá)下調(diào)能夠有效抑制VEGF 的表達(dá)，使腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制。筆者考慮EMMPRIN 基因促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖可能也是依靠上述機(jī)制。

Marrieb［8］在對(duì)EMMPRIN 與乳腺癌系細(xì)胞株凋亡的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn):將EMMRPIN 基因?qū)氲侥[瘤細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞凋亡明顯減少，其機(jī)制是EMMPRIN 主要是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的錨著非依賴(lài)性生長(zhǎng)，從而對(duì)抗細(xì)胞失巢凋亡。并且腫瘤細(xì)胞這種錨著非依賴(lài)性生長(zhǎng)是與P13K 與ErK 兩種細(xì)胞存活信號(hào)通路的活化是密切相關(guān)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞株中EMMPRIN 基因的表達(dá)，能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率明顯升高，與在乳腺癌等其他惡性腫瘤中所得結(jié)果一致。結(jié)合EMMPRIN 基因在其他惡性腫瘤中對(duì)抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究結(jié)果，筆者考慮EMMPRIN 基因在膠質(zhì)瘤中可能也是通過(guò)某種細(xì)胞存活信號(hào)通路的活化對(duì)抗細(xì)胞凋亡，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床早期診斷和預(yù)防困難，治療棘手，同時(shí)致殘率、病死率均極高。膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制未完全闡明是造成這一局面的主要原因。研究表明，分子遺傳學(xué)在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中起著巨大的作用。本實(shí)驗(yàn)以EMMPRIN 基因?yàn)榘悬c(diǎn)，以人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)RNAi 技術(shù)，探討EMMPRIN 基因表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖、凋亡的相關(guān)性，為以EMMPRIN 基因?yàn)榘悬c(diǎn)的基因治療提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為人腦膠質(zhì)瘤的治療開(kāi)辟了新的途徑。但EMMPRIN 基因在促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖，對(duì)抗細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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