張翠莉，劉 萍，魏文波

臨床標(biāo)本不僅種類多樣，如血清、血漿、膿液、腦脊液、痰、分泌物等，并且同類型標(biāo)本也可有不同的性質(zhì)，如血清標(biāo)本會有不同程度的溶血、脂血標(biāo)本等。筆者利用實時熒光定量PCR 方法檢測不同程度脂血、溶血標(biāo)本中乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)的結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以研究脂血、溶血是否影響熒光定量PCR 擴(kuò)增HBV DNA 結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熒光定量PCR 儀(型號:DA7600，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司);HBV DNA 試劑(達(dá)安基因有限公司，批號2010004);日立7180 全自動生化儀;紫外可見分光光度計;三酰甘油(triglyceride，TG)生化試劑(浙江伊利康生物技術(shù)有限公司，批號為20100105)。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 研究乳糜狀脂血因素實驗的標(biāo)本收集 收集武警四川總隊醫(yī)院2010－04 至2010－05 血脂正常、無溶血的HBV DNA 血標(biāo)本共30 例，每例采集血液3 ml。根據(jù)HBV DNA 濃度將所收集的30 例標(biāo)本分為兩個水平:中高HBV DNA 濃度，即HBV DNA≥1.0 ×105標(biāo)本15 例，設(shè)定為Ⅰ水平;HBV DNA 臨界濃度1.0 ×103至1.0 ×104標(biāo)本15 例，設(shè)定為Ⅱ水平。收集乙肝表面抗體(HBsAb)陽性或兩對半全陰性、肝功能正常、無溶血的重度乳糜狀脂血標(biāo)本及正常人血清標(biāo)本各5 例，每例采集血液3 ml，及時分離血清，－20 ℃保存。

1.2.2 研究溶血因素實驗的標(biāo)本收集 收集臨床乙肝患者無脂血、無黃疸血標(biāo)本30 例，每人同時采集3 管，每管3 ml，其中兩管－20 ℃冷凍不同時間致不同程度溶血［1］，留做平行實驗。

1.3 方法

1.3.1 實驗設(shè)計 設(shè)計不同血脂(三酰甘油)濃度和不同溶血程度的標(biāo)本，并研究兩種因素對熒光定量PCR 測定兩個水平HBV DNA 結(jié)果是否有影響。

1.3.2 標(biāo)本制作

1.3.2.1 兩種水平HBV DNA 不同TG 濃度標(biāo)本的制作 (1)按照HBV DNA 濃度將臨床收集的標(biāo)本分為兩個水平，分別為中高濃度HBV DNA≥1.0×10515 份(Ⅰ水平);臨界濃度，HBV DNA 介于1.0 ×103～1.0 ×10415 份(Ⅱ水平)。(2)按照美國國家膽固醇教育計劃的成人治療專家組Ⅲ(NCEPATP Ⅲ)血脂標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合本實驗，制作3 種TG 濃度梯度標(biāo)本，極高TG 濃度脂血(TG≥5.64 mmol/L，A組)、高TG 濃度(TG 2.26 ～5.63 mmol/L，B 組)及正常血脂濃度標(biāo)本(C 組)。(3)將所收集的重度乳糜狀的脂血標(biāo)本混勻，進(jìn)行TG 檢測，TG 為13.88 mmol/L;(4)HBV DNAⅠ水平不同濃度TG 標(biāo)本的制作:AⅠ組:重度乳糜狀標(biāo)本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =1∶0∶1。BⅠ組:重度乳糜狀標(biāo)本∶正常人血清:HBV DNAⅠ水平 =0.5∶0.5∶1。CⅠ組:重度乳糜狀標(biāo)本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =0∶1∶1。(5)HBV DNAⅡ水平不同濃度TG 標(biāo)本的制作:AⅡ組:重度乳糜狀標(biāo)本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =1∶0∶1。BⅡ組:重度乳糜狀標(biāo)本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平=0.5∶0.5∶1。CⅡ組:重度乳糜狀標(biāo)本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =0∶1∶1。

1.3.2.2 兩種水平HBV DNA 不同溶血程度標(biāo)本制作 采用－20 ℃冰箱冷凍不同時間，導(dǎo)致標(biāo)本不同程度溶血，利用分光光度計氰化高鐵血紅蛋白測定法，檢測血紅蛋白濃度，從而將溶血標(biāo)本分為重度溶血組(血紅蛋白＞5.0 g/L，D 組)、輕中度溶血組(0.8g/L ＜血紅蛋白＜5.0 g/L，E 組)［1］、無溶血組(F 組)。(1)HBV DNAⅠ水平3 種溶血標(biāo)本，即:DⅠ組、EⅠ組、FⅠ組;(2)HBV DNAⅡ水平3 種溶血標(biāo)本，即:DⅡ組、EⅡ組、FⅡ組。

1.3.3 HBV DNA 提取和檢測 參照達(dá)安基因公司試劑盒說明書進(jìn)行，待測標(biāo)本與室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)本同時進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對三組標(biāo)本PCR 結(jié)果取對數(shù)(Log10)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，其結(jié)果符合正態(tài)分布，對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，結(jié)果方差齊同。對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行F 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同TG 濃度對HBV DNA 實時熒光定量PCR結(jié)果的影響 ABC 三組不同TG 濃度對HBV DNAⅠ、Ⅱ水平實時熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果均無影響(P ＞0.05，表1)。

表1 不同TG 濃度對HBV DNA 熒光定量擴(kuò)增結(jié)果的影響(±s，U/ml)

表1 不同TG 濃度對HBV DNA 熒光定量擴(kuò)增結(jié)果的影響(±s，U/ml)

分組例數(shù)(n)HBV DNA 水平組ⅠⅡA156.26±0.913.12±0.71 B156.28±0.882.98±0.80 C156.57±0.983.09±0.69

2.2 不同溶血程度對HBV DNA 實時熒光定量PCR 結(jié)果的影響 在HBV DNAⅠ水平和Ⅱ水平中，不同程度的溶血對PCR 擴(kuò)增結(jié)果均無影響(P ＞0.05，表2)。

表2 不同程度溶血對HBV DNA 熒光定量擴(kuò)增結(jié)果的影響(±s，U/ml)

表2 不同程度溶血對HBV DNA 熒光定量擴(kuò)增結(jié)果的影響(±s，U/ml)

分組例數(shù)(n)HBV DNA 水平組ⅠⅡD156.13±0.893.35±0.80 E156.21±0.913.48±0.75 F156.17±0.933.43±0.78

3 討論

PCR 技術(shù)由于其極高的檢測靈敏度和特異性，在臨床疾病診斷和療效觀察上得到了廣泛的應(yīng)用，大大提高了疾病診斷的準(zhǔn)確性和快速性。熒光定量PCR 所采用的UNG 防污染技術(shù)和熒光探針標(biāo)記閉管檢測技術(shù)也有效控制了假陽性的發(fā)生。盡管如此，由于臨床標(biāo)本的多樣性，比如溶血、脂血、藥物等因素的存在，可能造成熒光定量PCR 檢測結(jié)果假陰性發(fā)生。有研究表明，溶血標(biāo)本因其血紅素及代謝產(chǎn)物的殘留抑制了DNA 聚合酶，會降低熒光定量PCR 結(jié)果，甚至出現(xiàn)假陰性［2，3］。黃其俊和吳堅敏［4］的研究表明，溶血程度不同對HBV DNA 定量結(jié)果的影響不同，即Hb ＞5.0 g/L 的重度溶血標(biāo)本會導(dǎo)致HBV DNA 熒光定量PCR 檢測結(jié)果降低，而輕度溶血標(biāo)本對HBV DNA 實時熒光定量結(jié)果的影響無顯著性差異。對于脂血是否影響熒光定量PCR 檢測結(jié)果的研究也存在矛盾之處。文獻(xiàn)［5，6］認(rèn)為，脂血會降低HBV DNA 檢測結(jié)果，并且隨著TG 水平的增高，對HBV DNA 結(jié)果影響越大。李小寧等［7］研究表明，高TG 乳糜狀血清不會對HBV DNA≥1.0 ×105的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

本研究結(jié)果表明，無論溶血程度如何，無論HBV DNA 濃度如何，溶血對HBV DNA 實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果的影響都無顯著性差異，且高血脂不僅不會影響中高濃度HBV DNA 檢測結(jié)果，對臨界濃度HBV DNA 結(jié)果的影響差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。本研究還對HBV DNA 濃度＜1.0 ×103的標(biāo)本進(jìn)行了脂血和溶血因素的研究，檢測結(jié)果也100%符合，表明脂血和溶血不會導(dǎo)致假陽性結(jié)果產(chǎn)生。

本實驗在提取核酸過程中，血紅蛋白能被有效地去除，故得出了血紅蛋白對熒光定量PCR 檢測HBV DNA 沒有差異性影響的結(jié)果，不同的血脂濃度對檢測結(jié)果的影響差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。對于與黃其俊等［4］研究結(jié)果的矛盾，可能是由于實驗設(shè)計和統(tǒng)計學(xué)處理的不同所導(dǎo)致。本研究設(shè)計的各溶血組(D、E 組)與對照組(F)均采用同一患者同時采集的樣本進(jìn)行，使得整個實驗更具有可比性，結(jié)果更具有說服力。在脂血是否影響實時熒光定量PCR 檢測HBV DNA 研究上，本研究結(jié)果與高峰等［5］的研究結(jié)果有差異，分析其原因可能是:(1)試劑靈敏度和特異性的差異;(2)統(tǒng)計學(xué)分析時所采用的標(biāo)準(zhǔn)及方法不同所造成。實驗本研究結(jié)果在同李小寧等［7］研究結(jié)果一致的同時，本研究還從HBV DNA 臨界值水平進(jìn)行了脂血對熒光定量PCR 方法是否具有影響的研究。從本研究所得出的結(jié)論可以看出，高血脂乳糜狀標(biāo)本不會影響熒光定量PCR 方法檢測HBV DNA。

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