朱秀麗，朱曉英，郭青玉，王 靜，溫德升，吳軍正

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是涎腺最常見的惡性腫瘤之一，約占30%，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，主要發(fā)生在肺部。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的本質(zhì)表現(xiàn)，MMP－1 是MMPs 家族中表達(dá)最高的降解纖維膠原的間質(zhì)膠原酶，許多腫瘤組織中有MMP－1 的過表達(dá)，其表達(dá)與侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。本研究利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建人MMP1 RNA 干擾表達(dá)載體，并試驗性轉(zhuǎn)染人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移性ACC－M 細(xì)胞株，驗證其對MMP1 的沉默作用，為進一步研究MMP1 對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響以及MMP1 特異性shRNA 真核表達(dá)載體的基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DNA Marker DL2000、T4 連接酶和限制性內(nèi)切酶BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ(Takara 公司，日本);TOP10 大腸桿菌(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔生物教研室保存);質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒(Omega 公司，美國);LipofectamineTM2000 和Trizol(Invitrogen 公司，美國);RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit(MBI Fermentas 公司，立陶宛)，MMP－1 山羊抗人多克隆抗體(Santa Cruz 公司，美國);FITC 標(biāo)記的山羊抗兔抗體(博士德，中國武漢);辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG 和DAB顯色試劑盒(北京中杉公司);ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Santa Cruz 公司，美國)。

1.2 質(zhì)粒和細(xì)胞 pWH1 真核表達(dá)載體由第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室吳元明構(gòu)建并惠贈，全長336 bp，具kana/neo 抗性。要表達(dá)的shRNA 插入到BglII 和HindIII 之間。人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC－2及其肺高轉(zhuǎn)移株ACC－M 由上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建立并惠贈，常規(guī)培養(yǎng)于100 ml/L 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，置37 ℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中。

1.3 引物的設(shè)計與合成 以人MMP－1 cDNA 基因(Genebank ID:NM－002421)序列中的103－121核苷酸為標(biāo)靶設(shè)計兩條引物，由上海Sangon 公司合成。序列為:P1:5'－GATCCCCTGTTCTGGGGTGTGGTGTCttcaagagaGACACCACACCCCAGAACATTTTTGG AAA－3' P2:5'－AGCTTTTCCAAAAATGTTCTGGGGTGTGGTGTCtctcttgaaGACACCACACCCCAGAAC AGGG－3'。

1. 4 構(gòu)建針對人MMP－1 基因的shRNA 表達(dá)載體pWH1－MMP1

1.4.1 引物處理 將上述引物用TE(pH 8.0)稀釋成0.05 nmol/ml，－20 ℃保存。

1.4.2 酶切 用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ對質(zhì)粒pWH1 做雙酶切。用膠回收試劑盒回收pWH1質(zhì)粒片段。

1.4.3 連接 反應(yīng)體系為pWH1 質(zhì)粒片段4 μl，退火產(chǎn)物4 μl，T4 連接酶1 μl，T4 連接酶buffer 1 μl。16 ℃連接過夜。

1.4.4 轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，鋪于LB Kana ﹢平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單克隆并提取質(zhì)粒。

1.4.5 酶切鑒定 用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ對候選陽性克隆質(zhì)粒做雙酶切鑒定，陽性克隆質(zhì)粒命名為pWH1－MMP1。

1.5 轉(zhuǎn)染 對數(shù)生長期ACC－M 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長滿底面約80%時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分為3 組:(1)實驗組，轉(zhuǎn)染pWH1－MMP1 質(zhì)粒;(2)空載體組，轉(zhuǎn)染pWH1 質(zhì)粒;(3)對照組，未轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按LipofectamineTM2000 說明書進行。

1.6 RT－PCR 鑒定細(xì)胞MMP1 mRNA 的表達(dá) 按照TRIzol?試劑說明書步驟提取實驗組、空載體組和對照組細(xì)胞總RNA，溶于20 μl DEPC 水中。按照First Strand cDNA Synthesis kit 使用說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以人β－actin 內(nèi)對照進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系:cDNA 各1 μl，MMP1 和β－actin 的上游引物和下游引物各1 μl、MasterMix 12.5 μl、DEPC處理水補至反應(yīng)體積25 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃40 s、45 ℃40 s、72 ℃40 s，循環(huán)26次;7 ℃延伸10 min。取5 ml 反應(yīng)液在12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳上進行擴增產(chǎn)物檢測分析。引物由上海Sangon 公司合成，序列如下:

人β－actin 引物長度680 bp，sense:5'－ATACGCTGGGATGAGCACTGG，antisense:5'－TCTTTGCGGATGTCCACGTC。人MMP－1 引物長度331 bp，sense:5'－CATGCTTTTCAACCAGGCCC;antisense:5'－ATTCTGTCCCTGAACAGCCC。

1.7 免疫組化方法 制備對數(shù)生長期Mc3 細(xì)胞爬片，95% 乙醇固定后，0.2% TritonX－100 處理10 min，按SP 免疫組化試劑盒步驟系列處理，DAB 顯色。空白對照以PBS 代替一抗。

1.8 Western blot 方法 應(yīng)用單去污裂解法提取三組細(xì)胞總蛋白，Bradford 比色法進行定量后，取等量樣本，收集蛋白。10% SDS－PAGE 蛋白電泳。轉(zhuǎn)移至NC 膜后用山羊抗人MMP－1 蛋白抗體進行Western 雜交檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15.0 軟件，計量資料采用±s 表示，關(guān)于灰度值各組之間的比較采用方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pWH1－MMP1 的酶切鑒定結(jié)果 用EcoRⅠ和HindⅢ對pWH1－MMP1 進行雙酶切鑒定，陽性克隆切下約310 bp 片段，陰性克隆切下約250 bp 片段(圖1)。

圖1 pWH1－MMP1 質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 RT－PCR 結(jié)果 三組細(xì)胞的內(nèi)參對照物β－actin mRNA 的條帶無明顯差別，而實驗組MMP1 條帶的亮度明顯低于空載體組和對照組，這提示MMP1 mRNA 在實驗組細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低(圖2)。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測MMP－1 蛋白結(jié)果 結(jié)果顯示，ACC－M 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pWH1 胞漿區(qū)顆粒狀棕黃色著色深而明顯，轉(zhuǎn)染pWH1－MMP1 的細(xì)胞胞漿區(qū)著色淡而淺。每組染色結(jié)果隨機抽取50 個細(xì)胞，采用病理圖像分析系統(tǒng)4.0 軟件進行灰度值檢測，ACC－M 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pWH1 的ACC－M 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pWH1－MMP1 的ACC－M 細(xì)胞胞漿灰度值分別為180.04±11.52、179.24 ±13.25 和120.85 ±12.16(P＜0.01)，可以看出，RNA 干涉后和親本細(xì)胞ACC－M相比MMP－1 基因的表達(dá)水平明顯下降(圖3)。

圖2 pWH1－MMP1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ACC－M 細(xì)胞后的RT－PCR 結(jié)果

圖3 pWH1－MMP1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ACC－M 細(xì)胞的免疫組化結(jié)果

2.4 Western blot 檢測MMP－1 蛋白結(jié)果 在預(yù)期大小位置(57ku)處實驗組MMP－1 蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組(圖4)。

圖4 pWH1－MMP1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ACC－M細(xì)胞的western blot 結(jié)果

3 討論

在基質(zhì)金屬蛋白酶家族中，MMP－1 是表達(dá)最高的降解纖維膠原的間質(zhì)膠原酶，許多腫瘤組織中有MMP－1 的過表達(dá)，其表達(dá)與侵襲轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)［1，2］。

Toruner 等［3］應(yīng)用Affymetrix Hu133A 基因芯片檢測了口腔鱗狀細(xì)胞癌組織的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)33 個上調(diào)基因，MMP－1 是其中之一，并經(jīng)RT－PCR 得到驗證。Bendardaf 等［4］應(yīng)用免疫組化法檢測了直腸癌中MMP－1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP－1 表達(dá)低的存活率高。Yamashita 等［5］研究了51 例食管癌，其中94.1%有MMP－1 mRNA 的表達(dá)，而在正常黏膜組織中卻未檢測到MMP－1 的表達(dá)，其研究結(jié)果提示MMP－1 參與腫瘤侵襲過程，與不良預(yù)后有關(guān)。Ito等［6］在研究MMP－1 與人胰腺導(dǎo)管腺癌的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，46 個胰腺癌病例中，72%MMP－1 蛋白染色陽性，原位雜交確認(rèn)了MMP－1 mRNA 在胰腺癌中的表達(dá)，Ito 還檢測了2 個胰腺癌細(xì)胞系MMP－1 的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)MMP－1 陽性患者預(yù)后明顯不如MMP－1 陰性患者。Inoue 等［7］對103 例胃腸癌病例的研究發(fā)現(xiàn)，75.2%MMP－1 表達(dá)陽性，其表達(dá)與腹膜和淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，MMP－1 陽性患者預(yù)后不良。Boire 等［8］確定出一種能夠與特殊的蛋白酶活化受體(PAR1，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān))反應(yīng)的酶，即MMP－1，它能夠作為分子剪刀活化PAR1，從而刺激癌細(xì)胞的入侵和腫瘤的生長。

RNA 干涉(RNAi)技術(shù)能夠沉默靶基因，具有高度的特異性和高效性，用于多種基因功能的研究、腫瘤的試驗性治療等多項領(lǐng)域［9－12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在高轉(zhuǎn)移的人腺樣囊性癌ACC－M 細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)有高水平的MMP1 基因表達(dá)［13］，因此考慮MMP1 可能對人腺樣囊性癌生物學(xué)行為發(fā)揮重要的作用。在此基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)siRNA 設(shè)計原則，設(shè)計合成了MMP－1 shRNA;利用RNAi 質(zhì)粒pWH1 成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pWH1－MMP1;確立了G418 篩選工作濃度為600 μg/ml;脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pWH1－MMP1 到ACC－M 細(xì)胞，經(jīng)G418 篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pWH1 和pWH1－MMP1 的ACC－M細(xì)胞。

RT－PCR 鑒定了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后ACC－M 細(xì)胞MMP－1 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ACC－M 細(xì)胞MMP－1 mRNA 幾乎不表達(dá)。提示所設(shè)計的MMP－1 shRNA 符合設(shè)計要求，具有靶向特異性，達(dá)到了抑制靶基因的效果。

免疫組化法和Western blot 對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞ACC－M 中MMP－1 蛋白表達(dá)水平的檢測進一步證實了MMP－1 shRNA 經(jīng)pWH1 載體導(dǎo)入ACC－M細(xì)胞后能有效發(fā)揮RNAi 的靶基因沉默效應(yīng)，即特異阻斷了MMP－1 在SACC 肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACCM 中的表達(dá)。

RNAi 技術(shù)成功地沉默了MMP－1 基因在ACC－M 細(xì)胞中的表達(dá)，鑒于MMP－1 基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，這一結(jié)果為進行以MMP－1 基因為靶點的抗腫瘤研究建立了初步的實驗?zāi)Ｐ?。這為進一步研究MMP1 對腺樣囊性癌以及其他腫瘤的生物學(xué)特性的影響，實驗性治療腺樣囊性癌以及其他腫瘤奠定了基礎(chǔ)。

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