楊桂蘭，李 貞，王佳媚，楊 甜，哈小琴，惠 玲，郭建魁

小檗堿是黃連的主要有效成分，具有廣譜抗菌、抗炎作用，但因口服吸收有限，臨床上主要用于治療腸道細(xì)菌感染?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明小檗堿具有多方面的藥理作用，可用于治療心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、腫瘤、消化性潰瘍及肝臟疾病[1]。目前，開發(fā)新的適應(yīng)證及尋找更加有效的新型衍生物成為該藥研究的熱點。HB-13是從小檗堿的眾多衍生物中篩選出的一個新的衍生化合物，其藥效和毒理學(xué)特點都源于小檗

堿，但又有量和質(zhì)的變化。本研究組前期的研究表明，HB-13較原代化合物更具備明確的抗炎、抗病毒等藥理活性[2]，并可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-10[3]。HB-13對人體和動物的多種細(xì)胞具有生理活性。本文進(jìn)一步研究了HB-13對P物質(zhì)誘導(dǎo)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）分泌γ干擾素（IFN-γ）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及藥物 HaCaT細(xì)胞株由西京醫(yī)院皮膚科實驗室惠贈，HB-13(純度99.30%)及雷公藤內(nèi)酯醇(T0)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所藥物研究室提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12（Gibco公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）及P物質(zhì)（Sigma公司），IFN-γ ELISA檢測試劑盒（武漢博士德公司），熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），全波長酶標(biāo)儀（Thermo公司）， PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，每1～2天換液1次，待細(xì)胞生長至80%融合后傳代，傳代2～3次后，選擇生長旺盛、形態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 藥物配制 用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基溶解[之前先用二甲基亞砜（DMSO）助溶]HB-13與T0并配制成所需濃度（HB-13終濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 μg/ml，T0終濃度為20 ng/ml）；P物質(zhì)用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基配制，終濃度為1×10-8mol/L；以上藥物置-20℃保存。

1.2.3 尋找HB-13作用于HaCaT細(xì)胞的安全濃度 將生長狀態(tài)良好的HaCaT細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并調(diào)整為2×104個/ml的單細(xì)胞懸液，傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μl。待細(xì)胞完全貼壁后，移去原有培養(yǎng)液，實驗組分別加入含上述不同濃度的HB-13；對照組加入DMEM/F12培養(yǎng)液。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，數(shù)值測量及計算時取6孔的平均值。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加入DMSO 200 μl，并充分振蕩使甲瓚結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀490 nm處測各孔A值。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ含量的檢測 2×104個/ml的HaCaT細(xì)胞單細(xì)胞懸液，傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μl。待細(xì)胞完全貼壁后，移去原有培養(yǎng)液，向培養(yǎng)體系中加入P物質(zhì)(1×10-8mol/L)，30 min后實驗組分別加入不同濃度（2.5、5、10 μg/ml）的HB-13溶液；T0組加入20 ng/ml的雷公藤內(nèi)酯醇作為陽性對照；陰性對照組中加入DMEM/F12培養(yǎng)液；每組設(shè)6個復(fù)孔，數(shù)值測量及計算時取6孔的平均值。分別培養(yǎng)12、24、48 h后，收集培養(yǎng)上清液，-20℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，檢測培養(yǎng)上清液中IFN-γ的表達(dá)。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)IFN-γ mRNA的檢測 ①總RNA的提取和cDNA的合成：在待測上清液中，按10 cm2（培養(yǎng)瓶面積）加入1ml trizol提取總RNA，嚴(yán)格按試劑盒說明操作。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性，紫外分光光度計檢測總RNA的含量和純度。cDNA的合成操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。②實時定量RT-PCR檢測IFN-γ mRNA：總反應(yīng)體系為20 μl，包括模板cDNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq 10 μl，上、下游引物各（IFN-γ或β-actin）0.8 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，滅菌蒸餾水6 μl。擴(kuò)增條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，循環(huán)40次。PCR過程設(shè)無模板陰性對照，每組3個復(fù)孔。引物如下：IFN-γ擴(kuò)增片段110 bp（上游為：5'- CAT CGT TTT GGG TTC TCT TG -3'，下游為：5'-TTC CAT TAT CCG CTA CAT CT -3'）；β-actin擴(kuò)增片段205 bp（上游為：5'-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3'，下游為：5'-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3'）。熒光定量RT-PCR的結(jié)果判斷以β-actin為內(nèi)參照的表達(dá)強(qiáng)度為基準(zhǔn)，校正值=目的基因定量結(jié)果/內(nèi)參定量結(jié)果；相對定量結(jié)果=檢驗樣品的校正值/對照樣品的校正值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。各組取6孔的平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)經(jīng)獨立樣本t檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B-13的安全濃度

HB-13 的濃度為 2.5、5、10 μg/ml時，HaCaT 細(xì)胞吸光度值分別為0.982±0.041，0.980±0.043，0.979±0.042，與對照組0.982±0.037相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而濃度為20、40、80 μg/ml時吸光度值分別為 0.728±0.052，0.564±0.053，0.323±0.053，明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。因此當(dāng) HB-13 濃度為 2.5、5、10 μg/ml時，HaCaT細(xì)胞生長正常，確定其為安全濃度。

2.2 培養(yǎng)上清液中IFN-γ含量

IFN-γ含量在不同濃度 (2.5、5、10 μg/ml)HB-13培養(yǎng)體系和不同培養(yǎng)時間上清中均較陽性對照組和陰性對照組顯著增高（均P＜0.01），而組內(nèi)含量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 HB-13對P物質(zhì)刺激HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ的影響 （ ±s，pg/ml）

表1 HB-13對P物質(zhì)刺激HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ的影響 （ ±s，pg/ml）

注：a:與對照組相比P＜0.01；b:與 T0組相比P＜0.01

組 別 12 h 24 h 48 h陰性對照組 42.358±7.143 43.641±8.426 42.102±2.526 T0組（20 ng/ml） 73.650±3.988 85.705±6.759 94.169±2.526 HB-13（2.5 μg/ml） 107.763±9.195ab 112.637±7.124ab 111.354±8.887ab HB-13（5 μg/ml） 111.611±4.065ab 110.328±5.604ab 115.971±7.096ab HB-13（10 μg/ml） 111.600±4.322ab 115.458±6.887ab 117.510±5.604ab

2.3 細(xì)胞內(nèi)IFN-γ mRNA表達(dá)水平

細(xì)胞經(jīng)不同濃度HB-13作用后，在不同時間段IFN-γ表達(dá)均較陰性對照組和陽性對照組明顯增加（P＜0.01）；但不同濃度組間無藥物濃度和作用時間的差異（P＞0.05）（表2）。

表2 HB-13對P物質(zhì)刺激HaCaT細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IFN-γ mRNA的影響 （ ±s）

表2 HB-13對P物質(zhì)刺激HaCaT細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IFN-γ mRNA的影響 （ ±s）

注：a:與對照組相比P＜0.01；b:與 T0組相比P＜0.01

組 別 12 h 24 h 48 h對照組 1±0.019 0.990±0.039 1.005±0.016 T0組（20 ng/ml） 1.399±0.036 1.498±0.040 1.545±0.042 HB-13（2.5 μg/ml） 1.861±0.046ab 2.013±0.050ab 1.906±0.023ab HB-13（5 μg/ml） 1.931±0.061ab 2.103±0.077ab 2.058±0.070ab HB-13（10 μg/ml） 2.012±0.070ab 2.146±0.032ab 2.175±0.032ab

3 討論

HB-13是從小檗堿衍生物中篩選出的新化合物，具有抗炎、抗病毒和抗增生活性。然而，目前對HB-13與上述活性之間的相關(guān)性及其作用機(jī)制還不明確。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，不僅有抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞活性，而且在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。IFN-γ可誘導(dǎo)rRNA合成，促進(jìn)免疫細(xì)胞表面Ⅰ類和Ⅱ類組織相容性抗原的表達(dá)，增強(qiáng)同種K細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性[6]。同時，IFN-γ還可激活NK細(xì)胞，刺激先天性的細(xì)胞免疫和特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫等，從而增強(qiáng)其抗病毒、抗腫瘤的功能[7,8]。P物質(zhì)是由神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)多肽，是過敏反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)的重要遞質(zhì)[4]，對免疫及炎癥反應(yīng)中炎癥細(xì)胞的募集具有重要作用[5]。因此，我們選用P物質(zhì)作為炎癥誘導(dǎo)劑。T0可能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的合成，具有明確的非特異性的抗炎作用，故本研究選用其作為陽性對照組誘導(dǎo)劑。其促進(jìn)IFN-γ分泌的具體機(jī)制尚未闡明。

我們采用MTT法檢測了不同濃度HB-13對HaCaT細(xì)胞的毒性，實驗證明，＜10 μg/ml的HB-13對HaCaT細(xì)胞是安全濃度；同時上述濃度的HB-13對炎癥遞質(zhì)P物質(zhì)作用下的HaCaT細(xì)胞分泌IFN-γ均有促進(jìn)作用。提示外用HB-13制劑可能通過促進(jìn)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞合成與分泌IFN-γ而發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥等藥理學(xué)作用。在本實驗所選濃度及時間范圍內(nèi)，HB-13誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞分泌IFN-γ，無時間及劑量依賴性，提示HB-13在皮膚中發(fā)揮其藥理學(xué)作用的濃度范圍較廣且作用時間較長。

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