孫 濤，孫 斐，巢 駿，謝 晶，周冬香

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海海洋大學海洋科學研究院，上海 201306）

自1985年發(fā)現(xiàn)富勒烯（C60為其代表物質(zhì)）以來[1]，關(guān)于水溶性C60衍生物抗氧化性的研究引起廣泛關(guān)注[2-4]。自由基是帶有未成對電子的分子或離子，生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除一般是平衡的，一旦失衡就會對機體造成氧化傷害，導致蛋白質(zhì)變性、酶失活、脂質(zhì)過氧化等[5-6]。金屬離子可催化自由基的產(chǎn)生。自由基氧化是一種自動鏈式反應，脂氧化酶或是光照可誘導反應發(fā)生，誘導劑是金屬離子。自由基氧化可以導致DNA斷裂，若在金屬離子的催化下，斷裂速度將會增加數(shù)倍。金屬離子同樣也是自由基氧化碳水化合物過程中的催化劑。體內(nèi)鈉鉀泵是自由基攻擊目標之一，在金屬離子的參與下，其損傷程度將會加劇。因此，金屬離子在自由基氧化過程中發(fā)揮著重要作用。

文獻已報道過C60-β-丙氨酸具有清除超氧陰離子、羥基自由基的能力[7]以及對由活性氧聚集引起的PC12細胞損傷的保護作用[8]，但是關(guān)于還原能力以及金屬螯合能力的研究尚未進行。本試驗合成了三種不同加成數(shù)目的水溶性C60-β-丙氨酸衍生物并對其還原能力及金屬螯合能力進行考察，以期為水溶性C60衍生物在生物醫(yī)學領(lǐng)域中應用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C60純度＞99.9%（河南永新試劑公司）；β-丙氨酸（上海國藥試劑有限公司）；菲洛嗪（美國Fluka公司）；甲苯、乙醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、氯化亞鐵等均為分析純。

Nicolet Nexus 470型紅外光譜儀（美國Nicolet）；UV-1800PC型紫外分光光度計（上海Mapada）；DMX 500型核磁共振波譜儀（德國Bruker）；MOD 1106型元素分析儀（意大利Cario Erba）；UV-2000型紫外分光光度計（上海尤尼柯）；TDL80-2B型臺式離心機（上海安亭）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅）；79-3型恒溫磁力攪拌器（上海司樂）；Delta 320型pH計（瑞士Mettler Toledo）；AB204-N型分析天平（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 C60-β-丙氨酸衍生物的合成

按照文獻[9]設計合成C60-β-丙氨酸衍生物的方法，分別取40.0 mg β-丙氨酸和2.0 g氫氧化鈉溶于12 mL去離子水中，加入80.0 mL無水乙醇，攪拌下緩慢滴加C60甲苯溶液（250.0 mg/250.0 mL），室溫下攪拌5 d，至有機層中紫色消失，說明C60已反應完全。分液移去無色有機層，將黑色溶液層用蒸餾水稀釋，再加入無水乙醇使產(chǎn)物沉淀，將產(chǎn)物用水和無水乙醇反復沉淀，40℃經(jīng)真空干燥得到黑褐色固體粉末A。茚三酮試驗顯示產(chǎn)物中不含游離β-丙氨酸。將β-丙氨酸用量分別改為200.0 mg和2.5 g，重復上述實驗，分別得到黑褐色的固體粉末B和C。

1.3 C60-β-丙氨酸衍生物的表征

對產(chǎn)物A、B和C進行FT-IR、UV、1H MNR和元素分析（C、N、H）測試。紅外光譜采用KBr壓片法制樣，測定波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為2 cm-1。紫外光譜，測定波長范圍為200～800 nm，分辨率為0.5 nm。核磁共振，500 MHz，溶劑D2O。

1.4 還原能力的測定

還原能力測試根據(jù)文獻[10]測定并稍做改進。取2.0 mL不同濃度樣品，加入pH 6.60的0.2 mol·L-1磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻。50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后在3 000 r·min-1下離心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min后在700 nm處測定吸光度。

1.5 金屬螯合能力的測定

按文獻[11]稍加修改測定反應產(chǎn)物的金屬螯合能力。取不同濃度的樣品溶液3.5 mL，加入0.1 mL 2.0 mmol·L-1的氯化亞鐵溶液和0.2 mL 5.0 mmol·L-1的菲洛嗪溶液，混和均勻?；旌弦菏覝仂o置10 min，并于562 nm處測定其吸光度。計算其金屬螯合能力：螯合能力（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。式中，A0-用水代替樣品所測得的吸光度；Ai-樣品所測得的吸光度；Aj-樣品本身的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)表征

C60-β-丙氨酸衍生物的紅外圖譜如圖1所示，三種衍生物A、B、C均有在521 cm-1處的吸收峰（C60的特征吸收峰），1 066 cm-1處的吸收峰（NC60），1 400 cm-1處的吸收峰（COO-），1 560 cm-1處的吸收峰（C-N），3 414 cm-1處吸收峰（N-H），與文獻[9]報道一致，表明合成出的產(chǎn)物是C60-β-丙氨酸衍生物。

C60、β-丙氨酸和C60-β-丙氨酸衍生物的紫外圖譜（見圖2），β-丙氨酸和C60-β-丙氨酸衍生物在210 nm處有吸收峰，C60在296 nm處和353 nm處有吸收峰，說明C60-β-丙氨酸衍生物保留β-丙氨酸的吸收峰，但在C60原有吸收峰處發(fā)生改變。

C60-β-丙氨酸衍生物的1H NMR圖譜（D2O，500 MHz）如圖3所示，在1.1、3.4 ppm處的吸收峰是C60-H的吸收峰，與文獻[8]報道一致。

元素分析結(jié)果顯示，C60-β-丙氨酸衍生物A、B和C中碳∶氮∶氫的比例分別為60.7∶2∶1、30.3∶2∶1、17.9∶2∶1，說明C60-β-丙氨酸衍生物A、B和C中與C60上連接的β-丙氨酸的平均數(shù)目分別是2，4，8（計算值分別為1.85，4.09，8.07）。

圖1 C60-β-丙氨酸衍生物的紅外圖譜Fig.1 FTIR spectra of β-alanine C60derivatives

圖2 C60-β-丙氨酸衍生物的紫外圖譜Fig.2 UV spectrogram of β-alanine C60derivatives

圖3 C60-β-丙氨酸衍生物的1H NMR圖譜Fig.3 1H NMR of β-alanine C60derivatives

2.2 還原能力

C60-β-丙氨酸衍生物的還原能力如圖4所示，隨濃度增加，三種衍生物A、B和C的吸光值增加，還原能力增強。同時，β-丙氨酸在這個濃度范圍內(nèi)無還原能力。在濃度為2.5 μmol·mL-1時，三種衍生物A、B和C的吸光度分別是0.424，0.612和1.040。還原能力大小順序為C＞B＞A，即隨加成度增加，C60-β-丙氨酸衍生物的還原能力增強。

圖4 C60-β-丙氨酸衍生物的還原能力曲線Fig.4 Reducing power of β-alanine C60derivatives

2.3 金屬螯合能力

C60-β-丙氨酸衍生物的金屬螯合能力如圖5所示，隨著濃度的增加，三種衍生物A、B和C的金屬螯合能力逐漸增強。同時，β-丙氨酸在這個濃度范圍內(nèi)幾乎沒有金屬螯合能力。當螯合率達到50%時，所需三種衍生物A、B和C的濃度分別是0.348、0.261和0.135 μmol·mL-1。它們的金屬螯合能力大小順序為C＞B＞A，即隨著加成度的增加，C60-β-丙氨酸衍生物的金屬螯合能力不斷增強。

圖5 C60-β-丙氨酸衍生物的金屬螯合能力曲線Fig.5 Chelating ability of β-alanine C60derivatives

3 討論與結(jié)論

a.C60-β-丙氨酸衍生物的還原能力主要與C60-β-丙氨酸衍生物分子上C=C雙鍵的數(shù)量、位阻效應和加成基團的性質(zhì)有關(guān)[12]。在還原能力測試中，β-丙氨酸無還原能力，而富勒烯化學研究表明，富勒烯還原金屬離子主要是通過打開C=C雙鍵來提供電子[3]，因此C60-β-丙氨酸衍生物的還原能力主要來自于C60上保留下來的雙鍵。C60與胺類物質(zhì)之間的反應傾向于1，2-加成或1，4-加成反應[13]。隨著加成基團的增加，阻礙鐵離子進攻C=C雙鍵所形成的空間位阻增大，導致C60-β-丙氨酸衍生物的還原能力降低。β-丙氨酸與C60以一個-NH基相連，-NH基是一個強供電子基團，其供電效應使具有不飽和烯烴性質(zhì)的C60上的C=C雙鍵的電荷密度增大，C=C雙鍵給出電子，還原能力增強。三種C60-β-丙氨酸衍生物還原能力的大小順序為C＞B＞A，說明在這個體系中-NH基供電效應對C60-β-丙氨酸衍生物還原能力占主導因素。

b.一些不飽和烯烴如乙烯（CH2=CH2）、乙炔（CH≡CH）可與金屬離子形成配合物。具有成鍵π電子和能量較高的空π*分子軌道，給出其成鍵π電子與金屬離子形成σ配位鍵或者其空軌道接受金屬離子的電子形成反饋π鍵配位鍵。C60具有不飽和烯烴的性質(zhì)，與金屬離子形成配位鍵[14]。隨著C60-β-丙氨酸衍生物側(cè)鏈β-丙氨酸以及-NH基數(shù)目的增加，分子極性增強，π鍵電子云密度也不斷增加，使C=C雙鍵更容易與金屬離子形成配位鍵，因此C60-β-丙氨酸衍生物的金屬螯合能力不斷增強。三種C60-β-丙氨酸衍生物金屬螯合能力的大小順序為C＞B＞A，即隨加成度增加，C60-β-丙氨酸衍生物的β-丙氨酸側(cè)鏈數(shù)量增加，金屬螯合能力增強。

[1]Kroto H W,Heath J R,O'Brien S C,et al.C60:Buckminsterfullerene[J].Nature,1985,318:162-163.

[2]葉光明,吳秋業(yè),姜云云,等.富勒烯在醫(yī)藥領(lǐng)域中的研究進展[J].藥學實踐雜志,2004,22(2):73-76.

[3]Chiang L Y,Lu F J,Lin J T.Free-radical scavenging activity of water-soluble fullerenols[J].J Chem Soc Chem Commun,1995(12):1283-1284.

[4]江貴長,鄭啟新.富勒烯-賴氨酸衍生物的合成及其體外抗癌活性研究[J].材料導報,2005,19(8):135-138.

[5]Fridovich I.The biology of oxygen radicals[J].Science,1978,201:875-880.

[6]Nordberg J,Arner E S J.Reactive oxygen species,antioxidants,and the mammalian thioredoxin system[J].Free Radic Biol Med,2001,31(11):1287-1312.

[7]Sun T,Xu Z D.Radical scavenging activities of α-alanine C60adduct[J].Bioorg Med Chem Lett,2006,16(14):3731-3734.

[8]Hu Z,Guan W C,Wang W,et al.Synthesis of β-alanine C60derivative and its protective effect on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat pheochromocytoma cells[J].Cell Biol Int,2007,31(8):798-804.

[9]Gan L B,Luo C P,Xu L B,et al.Water-soluble fullerene derivatives,synthesis and characterization of β-alanine C60adducts[J].Chinese Chemical Letters,1994,5(4):275-278.

[10]Yen G C,Chen H Y.Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity[J].J Agri Food Chem,1995,43(1):27-32.

[11]Chan E W C,Lim Y Y,Chew Y L.Antioxidant activity of Camellia sinensis leaves and tea from a lowland plantation in Malaysia[J].Food Chem,2007,102(4):1214-1222.

[12]孫濤,徐鑄德,賈之慎.功能化基團對C60-β-丙氨酸衍生物清除超氧陰離子自由基O2能力的影響[J].高等學?；瘜W學報,2003,24(7):1231-1233.

[13]Miller G P.Reactions between aliphatic amines and fullerene:A review[J].C R Chim,2006,9(7-8):952-959.

[14]Wu Z Y,Lin Y S,Chen D D,et al.Synthesis and redox properties study of C60RuH2(CO)(PPh3)complex[J].Chin J Inorg Chem,2001,17(6):883-887.