劉 寧，魯志剛

（1.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；3.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是人體腸道內(nèi)最主要的生理性有益菌，與人體的許多病理、生理現(xiàn)象密切相關(guān)。雙歧桿菌在體內(nèi)發(fā)揮著許多重要的生理功能，如生物屏障、抗衰老、改善乳糖消化不良和營(yíng)養(yǎng)免疫等，其中抗腫瘤作用是最受關(guān)注的功能之中。雙歧桿菌活體、滅活菌體、完整的細(xì)胞壁肽多糖、胞外多糖及細(xì)菌素等均有較高的抗腫瘤活性。脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）是普遍存在于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的一種成分。目前國(guó)內(nèi)對(duì)雙歧桿菌研究的較多，主要集中在免疫激活、抗突變、抗衰老、粘附及腫瘤等方面[1]。

鞘磷脂（Sphingolipid）是所有真核生物的細(xì)胞膜中普遍存在的組分。在鞘磷脂類物質(zhì)的代謝中，神經(jīng)酰胺（Ceramide，Cer）是一種細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)分子，細(xì)胞內(nèi)Cer水平升高能直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而其下游代謝產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇（S1P）則可以通過(guò)多種途徑抑制凋亡、促進(jìn)存活，它們之間相對(duì)平衡決定細(xì)胞增殖或死亡。鞘氨醇激酶 1（Sphingosine kinase 1，SphK1）是這種動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，同時(shí)其自身也是一種癌基因[2]。

本研究從鞘磷脂信號(hào)通路出發(fā)，應(yīng)用RTPCR和Western blot探討雙歧桿菌LTA對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞內(nèi)SphK1表達(dá)是否具有抑制作用，為闡明脂磷壁酸抑制胃癌的機(jī)理作進(jìn)一步的探討，同時(shí)也為發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的有效靶標(biāo)提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

雙歧桿菌LTA的制備參考樂(lè)軍等的方法[3]，用非離子型去垢劑Triton X-114提取，通過(guò)DEAESephacel陰離子交換色譜純化；胃癌SGC7901細(xì)胞株（購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)）；Trizol（購(gòu)自Invitrogen公司）；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自北京天根公司）；SphK1和GAPDH引物序列由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成；兔源SphK1抗體（一抗）（購(gòu)自Cell Signaling Technology）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG（二抗）（來(lái)自于北京中杉金橋公司）；ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自南京凱基生物）；RPMI 1640（購(gòu)自Invitrogen公司）；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青。

1.2 方法

1.2.1 半定量RT-PCR檢測(cè)SphK1 mRNA表達(dá)

引物用Primer5設(shè)計(jì)完成，序列如下：SphK1 Forward∶5'TGGATGGTCAGCGGTTGC 3'，Reverse∶5'CTGGGAATGTCACTTTATTTGGAT 3'，擴(kuò)增片斷為348 bp；GAPDH Forward∶5'TCCCATCACCATCTTC CAG 3'， Reverse∶5'ATGAGTCCTTCCACGATACC 3'，擴(kuò)增片斷為309 bp。

細(xì)胞經(jīng)0、200、500 μg·mL-1LTA處理72 h后收集細(xì)胞并加入1 mL Trizol進(jìn)行總RNA的提取，用分光光度計(jì)根據(jù)OD260和OD280進(jìn)行RNA濃度的測(cè)定。隨后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系為20 μL，包括：2 μL 10 × RT Mix，2 μL超純dNTP，2 μL Oligo-dT15，1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，3 μL Rnase-free水，10 μL模板RNA。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL Master Mix，上下游引物各1 μL，cDNA模板5 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。擴(kuò)增條件為：95℃5 min;95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取 PCR 產(chǎn)物 5 μL 與 1 μL 6×Loading Buffer混合上樣于1%瓊脂糖凝膠，100 mA，電泳40 min后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并成像?；叶确治鍪褂肐mage J軟件。

1.2.2 Western blot檢測(cè)SphK1蛋白表達(dá)

細(xì)胞經(jīng) 0，200，500 μg·mL-1LTA 處理 72 h后，用預(yù)冷的PBS洗兩次，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，調(diào)整蛋白量為20～25與5×SDS上樣緩沖液以4∶1的比例混勻，煮沸變性5 min。12 000 g離心取上清于10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離。電泳條件為濃縮膠80 V，分離膠120 V。隨后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（NC）膜上，用含5%的脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h。按說(shuō)明書比例稀釋一抗，將膜在4℃雜交過(guò)夜，然后用TBST洗去多余未結(jié)合的抗體，室溫洗滌3次，每次15 min。隨后用二抗室溫?fù)u動(dòng)1～2 h進(jìn)行結(jié)合，用TBST洗膜3次去掉多余抗體，每次15 min。最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑（ECL）于暗室中進(jìn)行曝光及顯影定影，將膠片掃描成像，進(jìn)行灰度分析。以α-tubulin作為內(nèi)參進(jìn)行檢測(cè)。

細(xì)胞裂解液的組分為：20 mmol·L-1Tris，pH 7.4；20%甘油；1 mmol·L-1β-巰基乙醇；1 mmol·L-1EDTA；5 mmol·L-1原釩酸鈉；15 mmol·L-1NaF；40 mmol·L-1β-甘油磷酸；10 μg·mL-1亮肽素和抑肽酶；1 mol·L-1PMSF（臨用前補(bǔ)加）。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）形式表示。與對(duì)照組的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著。統(tǒng)計(jì)分析及作圖使用OriginPro 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌LTA對(duì)SGC7901細(xì)胞內(nèi)SphK1基因表達(dá)的影響

圖1是分別用 0，200，500 μg·mL-1處理72 h后SGC7901細(xì)胞內(nèi)SphK1基因和GAPDH表達(dá)的結(jié)果。利用Image J進(jìn)行灰度分析，SphK1條帶灰度值除以GAPDH條帶灰度值為SphK1相對(duì)表達(dá)量（Relative Expression，R.E.），結(jié)果如下：

對(duì)照：1.23±0.04；200 μg·mL-1LTA處理：0.54±0.01；500 μg·mL-1LTA 處理：0.20±0.02。結(jié)果表明LTA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)SphK1基因有明顯的抑制作用（P＜0.01），高濃度LTA抑制作用更大（見圖1、2）。

圖1 RT-PCR檢測(cè)LTA處理72 h后SphK1基因表達(dá)Fig.1 SphK1 gene expression by RT-PCR after treatment with LTA for 72 h

圖2 LTA處理72 h后SphK1基因相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of SphK1 gene after treatment with LTA for 72 h

2.2 雙歧桿菌LTA對(duì)SGC7901細(xì)胞內(nèi)SphK1蛋白表達(dá)的影響

LTA處理72 h后用Western Blot檢測(cè)SGC7901細(xì)胞內(nèi)SphK1蛋白如圖3所示，經(jīng)灰度分析結(jié)果如下：對(duì)照組為0.91±0.03，200 μg·mL-1LTA處理組為0.82±0.04，500 μg·mL-1LTA處理組為0.49±0.02（見圖3、4）。

圖3 LTA處理72 h后的SphK1蛋白表達(dá)Fig.3 SphK1 protein expressions after treatment with LTA for 72 h

圖4 LTA處理72 h后SphK1蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of SphK1 protein after treatment with LTA for 72 h

3 討論

雙歧桿菌的表面分子LTA對(duì)多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞都具有直接的生長(zhǎng)抑制作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化，國(guó)內(nèi)對(duì)其作用機(jī)制研究較多。研究顯示LTA對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖有抑制作用，并隨著其濃度升高而增強(qiáng)；利用TUNEL法觀察LTA處理后的細(xì)胞，出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象（數(shù)據(jù)未顯示）。由于鞘磷脂信號(hào)在細(xì)胞凋亡中的作用逐漸被研究證實(shí)，LTA誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞調(diào)亡通過(guò)抑制這一通路實(shí)現(xiàn)。

鞘磷脂代謝物在介導(dǎo)癌細(xì)胞存活、死亡和分化的信號(hào)途徑中起關(guān)鍵作用。Cer和S1P之間比例形成的“鞘磷脂變阻器”決定了一個(gè)細(xì)胞是死亡還是存活。SphK1是最重要并直接調(diào)節(jié)這些鞘磷脂信使的介導(dǎo)者[4]，同時(shí)其自身也是一種癌基因。研究發(fā)現(xiàn)SphK1 mRNA在許多腫瘤組織和細(xì)胞中都有高表達(dá)[5]，使得它成為一種公認(rèn)的治療癌癥的鞘標(biāo)。最新的研究表明SphK1表達(dá)的高低與胃癌的發(fā)展和較低的患者存活率相關(guān)[6]，因此抑制SphK1表達(dá)是發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制所在，也是進(jìn)行新型藥物開發(fā)的有力支持。目前一些具有藥理活性的復(fù)合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)或分離出來(lái)，其中一些來(lái)源于微生物[7-8]，還有一些是合成的鞘磷脂類似物[2,9]。

本研究利用不同濃度LTA處理胃癌SGC7901細(xì)胞后檢測(cè)其SphK1基因和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示200、500 μg·mL-1的LTA對(duì)SphK1的基因和蛋白表達(dá)均具有明顯的抑制作用，且500 μg·mL-1LTA抑制作用更強(qiáng)。研究結(jié)果表明，雙歧桿菌LTA能夠抑制胃癌SGC7901細(xì)胞內(nèi)SphK1基因和蛋白表達(dá)，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。抑制的結(jié)果是一方面可以有效地抑制促存活的S1P的生成，增加促凋亡的Cer的生成；另一方面，由于SphK1自身也是一種癌基因，抑制其表達(dá)能夠從根本上抑制這一信號(hào)通路，最終的結(jié)果是促使細(xì)胞走向凋亡。研究結(jié)果印證并初步解釋了雙歧桿菌LTA抑制SGC7901細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究在一定程度上證明LTA作為一種天然產(chǎn)物有希望成為癌癥治療物質(zhì)，更重要的是為SphK1信號(hào)通路作為治療癌癥的靶標(biāo)提供有力支持。對(duì)于LTA抑制SphK1同時(shí)是否影響其他信號(hào)通路，還需進(jìn)一步研究。

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