陳 斌，張 琦，桂富榮，何永紅，劉云龍，李正躍，肖關(guān)麗云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，生物多樣性研究與應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程中心，農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明6500;云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明6500

西花薊馬Frankliniella occidentals(Pergande)是一種重要的農(nóng)林植物害蟲(呂要斌等，2004;吳青君等，2005)，其個(gè)體小，寄主植物廣泛，發(fā)生隱蔽，已對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生一定的抗性(Immaraju et al.，1992)。充分發(fā)揮天敵資源的作用，采用環(huán)境友好型的防治措施一直是建立西花薊馬防控體系和開(kāi)展綜合治理研究的重要內(nèi)容(Hall，1992)。

蟲生真菌能在自然條件下通過(guò)體壁直接侵染昆蟲(蒲哲龍和李增智，1996)，并能在自然條件下引發(fā)害蟲的流行病，因而已成為害蟲生物防治的重要手段之一。西花薊馬的寄生真菌有5種(張琦等，2010)，包括蠟蚧輪枝菌 Lecanicillium lecanii(Zimm.)(Saito，1992;Scott＆ Ronald，2002)、球孢白僵菌Beauveria bassiana(Balsama)Villemin(Maniania et al.，2003;Saito，1992)、金龜子綠僵菌 Metarizium anisopliae(Metsch)Somk(Lindquist，1996;Maniania et al.，2003)、玫煙色擬青霉 Paecilomyces fumeroseus(Wize)Brown ＆ Smith(Saito et al.，1989)、小孢新接霉Neozygites parvispora(Macleod＆Carl)(Montserrat et al.，1998)。

近年來(lái)，有關(guān)蟲生真菌對(duì)西花薊馬的毒力及控制效果的研究逐漸受到重視(張素華等，2009)。國(guó)外一些研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌和綠僵菌對(duì)西花薊馬具有較強(qiáng)的致病性和控制作用(Goodwin＆Steiner，1996;Gouli et al.，2008;Maniania et al.，2003;Shigeyuki et al.，2011);張素華等(2009)研究也發(fā)現(xiàn)，白僵菌對(duì)西花薊馬具有一定的致病力。本研究選用分離自不同寄主昆蟲體上的球孢白僵菌菌株，以室內(nèi)生測(cè)法研究其對(duì)西花薊馬的毒力，以期為西花薊馬的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

從田間采集西花薊馬，置于室內(nèi)智能人工氣候箱［(25±1) ℃，16L∶8D］中，用四季豆 Phaseolus vulgaris L.飼養(yǎng)，建立和擴(kuò)大其種群，連續(xù)飼養(yǎng)至第3代成蟲供試。

1.2 供試菌種

供試8個(gè)菌株分別采自云南省不同地區(qū)的罹病蟲體，分離培養(yǎng)后，根據(jù)分生孢子、菌絲等形態(tài)進(jìn)行菌種的種類鑒定(蒲哲龍和李增智，1996)，具體的采集地點(diǎn)及其原始寄主見(jiàn)表1。各菌株均保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲病原體實(shí)驗(yàn)室。

表1 供試球孢白僵菌菌株來(lái)源一覽表Table 1 The host species and geographical origin of B.bassiana isolates studied

1.3 孢子懸浮液的配制

將球孢白僵菌菌株接種于SDAY(葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL)平板培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。待大量產(chǎn)孢后，刮取孢子粉，用含0.1%吐溫-80濕潤(rùn)劑的磷酸緩沖液(0.003 mol·L-1KH2PO4，pH 7.0)配制分散均勻的孢子懸液，其濃度分別為1.25×104、1.25 ×105、1.25 ×106、1.25 ×107、1.25 ×108個(gè)·mL-1，備用。

1.4 生物測(cè)定

選取7日齡薊馬成蟲作為供試種群，每個(gè)培養(yǎng)皿(直徑12 cm，放1張濾紙)放置30頭，再在培養(yǎng)皿中放置3根四季豆。采用噴霧法(Jennifer et al.，2009)接種，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，以含0.1%吐溫-80濕潤(rùn)劑的0.003 mol·L-1磷酸緩沖液為空白對(duì)照，同時(shí)用無(wú)菌水保持濾紙濕潤(rùn)。在培養(yǎng)皿上覆以扎有適量小孔的保鮮膜。置于光照培養(yǎng)箱(25℃、RH 85%、光周期16L∶8D)中飼養(yǎng)，每24 h觀察、記錄1次死亡蟲體，連續(xù)記錄10 d并將死亡個(gè)體放入滅菌培養(yǎng)皿中，置于相同條件的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察，以確定死亡原因，將長(zhǎng)出菌絲的蟲體計(jì)為有效感染。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)CLL模型(時(shí)間—?jiǎng)┝俊劳雎?處理生物測(cè)定數(shù)據(jù)(唐啟義和馮明光，2002)。采用Duncan's新復(fù)極差多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。采用幾率值分析法，以時(shí)間(d)的對(duì)數(shù)值為X，死亡率的幾率值為Y，計(jì)算毒力回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對(duì)西花薊馬致死的毒力參數(shù)值

供試球孢白僵菌菌株BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbSM090521、BbYY090613、BbMZ051230接種處理后第1天，西花薊馬活躍性降低，行動(dòng)遲緩，開(kāi)始死亡，根據(jù)DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)CLL模型計(jì)算出各菌株侵染致病的劑量效應(yīng)參數(shù)值，分別為 1.43、0.87、0.93、0.98、1.23、0.92、1.07、0.86，表明各菌株對(duì)西花薊馬成蟲均具有致病性。其中，BbKM030716和BbXW060615的毒力強(qiáng)于其他菌株。

2.2 西花薊馬感染不同菌株后的校正死亡率

在1.25×104～1.25 ×108個(gè)·mL-1孢子濃度下，經(jīng)菌株 BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbYY090613、BbSM090521、BbMZ051230 處理的西花薊馬在接種后3～5 d達(dá)到死亡高峰，其校正死亡率隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，連續(xù)10 d內(nèi)校正死亡率分別為 44.13% ～ 98.49%、12.63% ～78.90%、30.36% ～ 96.92%、51.36% ～ 98.74%、26.14%～98.59%、7.27% ～78.71%、49.06% ～98.74%、27.67 ～87.36%。在高劑量1.25 ×107和1.25 ×108個(gè)·mL-1的孢子濃度下，薊馬最早于第1天死亡，最遲于第2天死亡，且校正死亡率上升速度因菌株而不同，BbKM030716和BbJS080625感染的薊馬的死亡率上升最快。西花薊馬接種 BbCG051229、BbSM090521和BbMZ051230后第10天的校正死亡率低于90%，分別為(78.90 ± 5.34)%、(78.71 ± 3.34)% 和(87.36 ±3.67)%，接種其他菌株后第10天的校正死亡率均達(dá)95%以 上。這 表 明菌 株 BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615對(duì)西花薊馬成蟲具有較強(qiáng)的毒力(圖1)。

2.3 不同菌株對(duì)西花薊馬成蟲的致死劑量和致死時(shí)間

2.3.1 致死中劑量(LC50)的對(duì)數(shù)值 根據(jù)生物測(cè)定數(shù)據(jù)的“時(shí)間—?jiǎng)┝俊劳雎省蹦M及參數(shù)估計(jì)，得出各菌株對(duì)西花薊馬成蟲的LC50的對(duì)數(shù)值。結(jié)果表明，接種后1～10 d，各菌株對(duì)西花薊馬成蟲侵染致病的LC50的對(duì)數(shù)值間差異顯著(F=30.97，P＜0.01)，即LC50的大小因菌株而異(表2)。球孢白僵菌對(duì)西花薊馬的致死劑量是時(shí)間的函數(shù)，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，表明劑量效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。接種 后 1 ～ 10 d，菌 株 BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbSM090521、BbYY090613、BbMZ051230對(duì)西花薊馬成蟲的LC50的對(duì)數(shù)值分別為(5.10 ± 0.24) ～ (10.26 ± 1.59)、(7.66 ±1.63) ～ (15.45 ± 1.15)、(5.98 ± 0.25) ～ (10.65 ±0.67)、(6.21 ±0.20) ～ (11.23 ±0.36)、(5.14 ±0.13)～(10.24 ± 1.34)、(6.82 ± 0.13) ～ (12.12 ± 0.68)、(6.19 ± 0.20) ～ (11.03 ± 0.64)、(6.65 ± 0.15) ～(11.46 ± 0.67)，則 LC50分別為 1.29 × 1010～ 1.26 ×107、7.72 ×1011～6.95 ×108、1.88 ×1010～ 5.80 ×107、3.20 ×1010～8.53 ×107、1.27 ×1010～1.28 ×107、6.86× 1010～ 2.18 × 108、2.68 × 1010～ 8.25 × 107、3.91 ×1010～1.69×108個(gè)·mL-1孢子濃度。其中，菌株BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615 的LC50低于其他菌株，表明其具有較高毒力。

2.3.2 致死中時(shí)(LT50) 由表3可以看出，在1.25×105～1.25 ×108個(gè)·mL-1孢子濃度下，不同菌株的 LT50間差異顯著(F=11.33，P ＜ 0.01)。LT50隨孢子濃度的增大而逐漸減小，表明球孢白僵菌對(duì)西花薊馬的致死劑量是時(shí)間的函數(shù)，隨著處理劑量的增大，各菌株的時(shí)間效應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)。當(dāng)孢子濃度為1.25 ×105～1.25 ×108個(gè)·mL-1時(shí)，球孢白僵菌菌株 BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbSM090521、BbYY090613、BbMZ051230的 LT50分別為(3.12 ±1.12) ～ (5.64 ±2.17)、(5.39 ±1.22) ～(9.21 ±3.23)、(3.71 ±1.12) ～ (9.81 ± 2.54)、(3.23 ±0.45) ～(6.49 ±2.67)、(3.77 ±0.67) ～ (8.89 ±3.23)、(4.51 ±1.22) ～ (10.75 ±2.37)、(5.35 ±1.12) ～(8.18 ±2.23)、(5.84 ±1.14) ～ (10.61 ±3.56)d。從上述結(jié)果可以看出，在供試菌株中，BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121和BbXW060615對(duì)西花薊馬成蟲的LT50最小，說(shuō)明它們對(duì)西花薊馬成蟲的致病性最強(qiáng)。

圖1 各菌株對(duì)西花薊馬成蟲的校正死亡率Fig.1 Corrected mortality of F.occidentalis after inoculation of B.bassiana

表2 各菌株對(duì)西花薊馬的LC50的對(duì)數(shù)值Table 2 Logarithmic value of LC50for B.bassiana isolates against adult thrips after inoculation

表3 各菌株對(duì)西花薊馬的LT50Table 3 LT50in days for B.bassiana isolates against adult of F.occidentalis

2.4 毒力回歸方程

對(duì)球孢白僵菌菌株 BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbSM090521、BbYY090613、BbMZ051230的接種劑量與致死時(shí)間進(jìn)行回歸分析，獲得各菌株侵染致病的毒力回歸方程(表4)。各菌株的卡方值(X2)分別為 0.458、0.648、1.274、1.877、0.657、1.743、1.895、0.360，這些值均小于 X2分布表中 P=0.05、df=3時(shí)的 X2(7.82)，表明回歸方程式可行。

表4 各菌株對(duì)西花薊馬的毒力回歸方程Table 4 Characterisation of virulence of various isolates of B.bassiana against F.occidentalis adults

3 討論

本研究采用噴霧法測(cè)定了各菌株對(duì)西花薊馬成蟲的毒力，以降低傳統(tǒng)浸漬法因浸漬接種時(shí)間差異帶來(lái)的誤差，對(duì)指導(dǎo)田間防治應(yīng)用更有意義。

本研究中，不同寄主來(lái)源的球孢白僵菌菌株對(duì)西花薊馬成蟲均具有一定的毒力。其中，在1.25×105～1.25×108個(gè)·mL-1孢子濃度下，菌株BbKM030706 的 LT50為 3.12 ～ 5.64 d，該結(jié) 果與Shigeyuki et al.(2011)報(bào)道的結(jié)果相似。從致死時(shí)間效 應(yīng) 來(lái) 看，在 8個(gè) 菌 株 中，BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121和 BbXW060615的毒力較強(qiáng)，用1.25×108個(gè)·mL-1孢子濃度接種后的LT50分別為(3.12 ± 1.12)、(3.71 ± 1.12)、(3.23 ± 0.45) 和(3.77 ± 0.67)d。從 致 死 劑 量 效 應(yīng) 來(lái) 看，菌 株BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121 和 BbXW060615接種后1～10 d對(duì)西花薊馬成蟲的LC50分別為1.29×1010～1.26 ×107、1.88 ×1010～5.80 ×107、3.20 ×1010～8.53×107和1.27 ×1010～1.28 ×107個(gè)·mL-1孢子濃度。從侵染致病校正死亡率來(lái)看，經(jīng)菌株BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615 處理后第10天，西花薊馬的校正死亡率分別為98.49%、96.92%、98.74%、98.59%。綜上所述，菌株BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121 和 BbXW060615對(duì)西花薊馬成蟲的毒力較強(qiáng)，可作為西方薊馬生防制劑開(kāi)發(fā)的潛力菌株。

球孢白僵菌作為一種最常見(jiàn)的昆蟲病原真菌，在害蟲生物防治中受到廣泛關(guān)注(Lacey＆Goettel，1995)。球孢白僵菌菌株的地理來(lái)源或寄主來(lái)源、菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率以及胞外蛋白酶水平等生物學(xué)性狀與菌株的毒力有關(guān)(蔡守平等，2008;何余容等，2004;劉玉軍等，2008;單樂(lè)天和馮明光，2006;Montserrat et al.，1998)。同時(shí)，不同溫度下，球孢白僵菌對(duì)西花薊馬的致病性不同(張素花等，2009)。因此，不同寄主來(lái)源的菌株對(duì)西花薊馬毒力差異的原因還有待進(jìn)一步研究。

本研究選用的球孢白僵菌菌株在室內(nèi)25℃條件下對(duì)西花薊馬成蟲具有較高的毒力，但在自然條件下，感染球孢白僵菌的西花薊馬罹病蟲體很少。因此，關(guān)于球孢白僵菌在田間自然條件下的侵染致病情況有待進(jìn)一步研究。

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