宋亞娜，蘇 軍，林 艷，王 鋒

福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點實驗室，福建福州350003

土壤氮素生物地球化學循環(huán)是土壤物質(zhì)能量循環(huán)的重要組成部分，它能夠影響土壤質(zhì)量、氮素的植物吸收利用及農(nóng)田等生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力、可持續(xù)性及環(huán)境變化。硝化作用是土壤氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，對土壤氮素養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化具有重要意義。氨氧化細菌是執(zhí)行硝化作用第一步的關(guān)鍵微生物，即將氨氧化為亞硝酸鹽，該步驟也是硝化速率的限制性環(huán)節(jié)(Phillips et al.，2000)。雖然在水稻淹水時土壤處于厭氧條件而抑制硝化作用，但由于水稻根系能夠分泌O2，為水稻根表和根際提供了充足的氧，足以支持非專一性的好氧微生物過程，而使水稻根際具有顯著硝化作用的可能(Brune et al.，2000)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，稻田土壤中不僅存在豐富的氨氧化微生物基因資源，而且其群落組成和豐度變化活躍。土壤類型、水稻品種、施肥及土壤pH等環(huán)境因素均可改變氨氧化細菌的群落組成或豐度(宋亞娜等，2009;鐘文輝等，2008;He et al.，2007;Nicol et al.，2008;Shen et al.，2008)。

在轉(zhuǎn)基因水稻栽培中引入外源基因，有可能改變轉(zhuǎn)基因作物的根系分泌物、根系及植株殘體的組成及其降解過程，從而影響土壤物質(zhì)能量的遷移轉(zhuǎn)化過程，改變土壤微生物組成及土壤中礦質(zhì)營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化循環(huán)(Masoero et al.，1999;Poerschmann et al.，2005、2008、2009;Saxena ＆ Stotzky，2001)。目前，已有研究表明，轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈的降解對土壤細菌和真菌群落沒有影響(Lu et al.，2010a、2010b;Wu et al.，2004)。但有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻對與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的功能微生物(如氨氧化細菌)群落結(jié)構(gòu)的影響還未見報道。

本研究通過3～4年的田間定位試驗研究連續(xù)種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻后土壤氨氧化細菌群落組成和豐度的變化，旨在為評價轉(zhuǎn)基因水稻種植的土壤生態(tài)風險提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻是由福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點實驗室研制的轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(GM)和非轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)明恢86(CK)。以三系水稻恢復(fù)系明恢86為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙T-抗蟲PCDMARUBAC載體中的cry1Ac(蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因)和cpti(修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因)2個抗蟲基因?qū)胨荆@得能穩(wěn)定遺傳和表達的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系科豐8號。以科豐8號的T8代純合株系為父本、Ⅱ-32A為母本配制成轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號。以轉(zhuǎn)基因水稻科豐8號的受體恢復(fù)系明恢86為父本、Ⅱ-32A為母本配制獲得非轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)明恢86。轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號于2006年獲得農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全委員會批準進行生產(chǎn)性試驗。

1.2 定位試驗

2008年開始在具有防護措施的聯(lián)動網(wǎng)室中建立水稻定位試驗。地點位于福建省福州市郊的“吳鳳水稻試驗基地”(26°01' 北緯、119°20'東經(jīng))。該試驗基地屬暖濕亞熱帶季風氣候，年無霜期長達326 d，年均氣溫19.6℃，平均濕度77%，年均降水量1342.5 mm。供試土壤為砂壤，土壤有機質(zhì)含量為 23.32 g·kg－1，pH 6.15，全氮 1.65 g·kg－1，全磷(P2O5)0.76 g·kg－1，全鉀(K2O)18.28 g·kg－1，速效氮 154.53 mg·kg－1，速效磷 31.34 mg·kg－1，速效鉀 70.52 mg·kg－1。

于2008、2009、2010和2011年連續(xù)4年種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因抗蟲水稻。挑選飽滿的水稻種子于30℃催芽2 d，選發(fā)芽勢強、整齊一致的種子播種，1個月后插秧，株行距為20 cm×20 cm，單本插。4年均作中稻栽培，5月播種，6月插秧，10月收獲。前一年收獲后留茬10 cm割稻，稻茬留田自然越冬。次年春季將稻茬翻入土中，于6月繼續(xù)按前一年的小區(qū)排列方式種植。每種材料設(shè)3次重復(fù)，6個小區(qū)隨機排列，每個小區(qū)種植水稻350株。定位試驗期間除不使用殺蟲劑外，水肥和田間管理措施等均按當?shù)爻Ｒ?guī)。

1.3 樣品采集

分別于2010(定位試驗第3年)和2011年(定位試驗第4年)水稻分蘗期(播種后60 d)、齊穗期(播種后90 d)及成熟期(播種后120 d)采集土壤樣品。采用五點取樣法，每次重復(fù)取5株水稻，將水稻整株挖起后取根系周圍分布密集的土層深度為10～20 cm的土壤，將5株水稻根系土壤混合為1個土樣，放入4℃冰盒中保存。于實驗室內(nèi)去除土樣根系、雜草和石塊等雜質(zhì)后混勻，分裝入50 mL塑料離心管中，－20℃保存以用于土壤微生物分析。

1.4 分析方法

1.4.1 土壤微生物總DNA提取 稱取0.5 g于－20℃保存的土壤樣品，采用FastDNA?SPIN Kit For Soil(Q BIOgene)試劑盒進行土壤微生物總DNA的提取，將DNA樣品于－20℃冰箱保存待用。

1.4.2 聚合酶鏈反應(yīng)—變性梯度凝膠電泳(PCRDGGE)分析 利用氨氧化細菌16S rRNA基因特異引物(Song et al.，2007)進行 PCR 擴增(表 1)，檢測氨氧化細菌群落組成。反應(yīng)體系50 μL，其中，2 μL稀釋5倍的DNA模板加反應(yīng)液48 μL，反應(yīng)液包括1 μL Taq DNA 聚合酶(2.5 U· L－1，天根生物公司，北京)，5 μL dNTPs(2 mmol·L－1各堿基，上海生物工程公司)，5 μL 10×PCR-buffer(10倍 PCR緩沖液，天根生物公司，北京)，前、后引物各4 μL(5 pmol· L－1，上海英駿生物工程公司)和 29 μL超純水。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳EB(溴化乙錠)染色檢查后，用40 μL PCR產(chǎn)物進行DGGE分析，采用梯度為35%～50%的8%聚丙烯酰胺凝膠［化學變性劑為100%尿素7 mol·L－1和40%(v/v)去離子甲酰胺］在1倍TAE緩沖液中于150 V、60℃下電泳5 h。電泳后用10 mL SYBR green I(Sigma)(1倍 TAE稀釋10000倍)核酸染料染色45 min，然后用Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。

表1 PCR擴增引物及反應(yīng)條件Table 1 Primers and PCR conditions used for the study

1.4.3 氨氧化細菌的豐度檢測 以土壤中氨氧化細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)表示氨氧化細菌豐度。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測稻田土壤中氨氧化細菌16S rRNA基因數(shù)量。如表1所示，氨氧化細菌的熒光定量PCR擴增采用16S rRNA基因特異引物，每個樣品進行3次重復(fù)。采用SYBR?Premix Ex TaqTM(TakaRa，大連)試劑盒于ABI PRISM7500 Real-Time PCR System擴增儀上進行絕對定量PCR分析。熒光定量 PCR反應(yīng)體系25 μL，其中，2 μL稀釋5倍的DNA模板加反應(yīng)液23 μL，反應(yīng)液包括12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(× 2)，0.5 μL ROX Reference DyeⅡ (×50)，前、后引物各 1 μL(5 pmol· L－1)和8 μL 超純水。

1.4.4 熒光定量PCR標準曲線的建立 以非轉(zhuǎn)基因水稻土樣提取的DNA為模板進行氨氧化細菌16S rRNA基因的PCR擴增(表1)。將100 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切下含有目的基因的片段約 465 bp，用 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(OMEGA，美國)膠回收試劑盒純化。按照試劑盒方法用pMD18-T載體連接PCR產(chǎn)物，以大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，在氨芐青霉素平板上進行藍白斑試驗篩選陽性克隆。取部分陽性轉(zhuǎn)化菌液送上海英駿生物工程有限公司測序，重組質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)GenBank Blast比對，與氨氧化細菌16S rRNA基因(EU127347)同源性達99%。這表明重組質(zhì)?？梢宰鳛榘毖趸毦M行絕對熒光定量PCR分析的標準DNA。利用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，然后用 Nanodrop(Gene Co.Ltd.，美國)測定重組質(zhì)粒DNA 的質(zhì)量濃度，為99.0 ng·L－1。根據(jù)已知重組質(zhì)粒全序列和阿伏伽德羅常數(shù)［6.02×1023(分子數(shù))·moL－1］計算氨氧化細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)，為5.86 ×1010(cells)·μL－1。以 10 倍梯度稀釋氨氧化細菌16S rRNA基因重組質(zhì)粒以進行熒光定量PCR檢測，每個稀釋濃度重復(fù)3次，獲得氨氧化細菌16S rRNA基因標準曲線。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity One(Bio-Rad)軟件對DGGE圖譜中DNA條帶的位置和亮度進行數(shù)字化;利用CANOCO 4.0(Microcomputer Power，Ithaca，USA)軟件，根據(jù)不同處理DGGE結(jié)果的條帶亮度和位置的數(shù)字化數(shù)值，以不同水稻材料及其生育期為環(huán)境因素對微生物群落結(jié)構(gòu)組成進行冗余分析(redundancy discriminate analysis，RDA)(Marschner et al.，2002)。利用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對土壤氨氧化細菌群落組成的影響

利用氨氧化細菌16S rRNA基因特異引物對稻田土壤氨氧化細菌群落組成進行PCR-DGGE分析(圖1)。由DGGE圖譜可見，無論在定位試驗第3年(圖1A)還是第4年(圖1B)，稻田土壤中都存在豐富的氨氧化細菌基因，各個樣品均呈現(xiàn)較多的DGGE條帶。不同DGGE條帶代表土壤中不同種類的氨氧化細菌，條帶亮度表示在本研究的PCR試驗條件下各類氨氧化細菌的相對豐度。

依據(jù)DGGE圖譜的條帶位置和亮度的數(shù)字化數(shù)值計算氨氧化細菌群落多樣性指數(shù)(Shannonwiener index)，結(jié)果如表2所示。在定位試驗第3、4年，水稻各生育期內(nèi)GM和CK的氨氧化細菌群落多樣性指數(shù)均沒有顯著差異。這表明種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻不會改變稻田土壤氨氧化細菌群落多樣性。另外，同一種水稻的氨氧化細菌群落多樣性指數(shù)在水稻不同生育期間的差異也不顯著。

由圖2可見，在定位試驗第3、4年，變異較大的x軸方向上的氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)分布差異主要表現(xiàn)在不同水稻生育期間，而同一生育期內(nèi)不同水稻材料的氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)分布較為接近。同時，經(jīng)RDA顯著性相關(guān)分析也顯示，這2年的土壤氨氧化細菌群落組成的變化只與水稻生育期存在顯著相關(guān)性，顯著性水平分別為0.002和0.018。這表明稻田土壤氨氧化細菌群落組成隨水稻生長而發(fā)生變化，但種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對土壤氨氧化細菌群落組成沒有明顯影響。

圖1 定位試驗第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細菌群落組成的DGGE圖譜Fig.1 DGGE images of community composition of ammoniaoxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

2.2 轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對土壤氨氧化細菌群落豐度的影響

利用氨氧化細菌16S rRNA基因的重組質(zhì)粒作為標準DNA建立了絕對熒光定量PCR的標準曲線(圖 3)。其中，標準曲線的 R2為 0.99，斜率為 3.05，線性范圍達到5個數(shù)量級，為5.86×103～5.86×107(cells)·μL－1。

依據(jù)標準曲線，用熒光定量PCR檢測到不同處理的土壤氨氧化細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)為1.66 ×106～1.85 ×107(copies)·g－1(干土)。在定位試驗第3、4年，土壤氨氧化細菌的豐度在水稻生長前期均隨水稻生長而增大，至水稻齊穗期時達到最大，之后逐漸減小(圖4)，GM和CK的氨氧化細菌豐度在齊穗期時均顯著高于分蘗期(P＜0.05);但在水稻生長過程中，氨氧化細菌豐度在GM和CK處理間的差異均未達到顯著性水平(P＞0.05)。由此可見，稻田土壤氨氧化細菌豐度受水稻生育期的影響較大，而轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對土壤氨氧化細菌豐度沒有明顯影響。

表2 定位試驗第3、4年稻田土壤氨氧化細菌群落的多樣性指數(shù)Table 2 The diversity of the ammonia-oxidizing bacterial community，characterised by the Shannon index of diversity，in the third and fourth year after establishment of the experimental field site

圖2 定位試驗第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細菌群落組成的冗余分析Fig.2 RDA of the community composition of ammonia-oxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

圖3 氨氧化細菌16S rRNA基因絕對熒光定量PCR標準曲線Fig.3 Standard curve of real-time PCR of 16S rRNA gene of ammonia-oxidizing bacteria

圖4 定位試驗第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細菌的豐度Fig.4 Abundance of ammonia-oxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

3 討論

目前，關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境微生物影響的研究結(jié)果因作物種類、目標基因、微生物種類等不同而存在差異。在對轉(zhuǎn)抗病基因木瓜的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因品種的種植能夠改變土壤真菌或細菌的群落組成(Wei et al.，2006)。而利用磷脂脂肪酸分析方法研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米間沒有顯著差異(Griffiths et al.，2005)。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的秸稈或根系還田對土壤細菌或真菌的群落組成也沒有明顯影響(Lu et al.，2010a、2010b)。轉(zhuǎn) Bt基因作物對土壤微生物沒有影響可能是由于Bt蛋白在土壤中可快 速 降 解 (Daudu et al.，2009;Wang et al.，2006)。

現(xiàn)有的關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻對環(huán)境微生物群落影響的研究多集中于土壤總微生物如細菌或真菌的群落方面，而對一些與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化更為密切相關(guān)的功能微生物的研究較少。本研究通過田間定位試驗分析了轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號連續(xù)種植第3、4年，對與土壤氮素轉(zhuǎn)換密切相關(guān)的氨氧化細菌群落組成和豐度的影響。結(jié)果表明，土壤氨氧化細菌的群落組成和豐度均只與水稻的生長發(fā)育期相關(guān)，而在轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻間沒有顯著差異?？梢?，田間種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對土壤氨氧化細菌多樣性沒有明顯影響。

同時，本研究采用了PCR-DGGE和熒光定量PCR分子生物學方法。由于土壤中大部分微生物是不可培養(yǎng)的，用常規(guī)的培養(yǎng)方法研究土壤微生物群落的局限性很大。而以 DNA為基礎(chǔ)的PCRDGGE方法能夠較全面地反映土壤微生物組成，熒光定量PCR方法更可準確檢測土壤微生物的豐度。另外，本研究通過連續(xù)4年的田間定位試驗，所得結(jié)果能更好地反映種植轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物的影響。本研究證明，在一定時期內(nèi)種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti抗蟲基因水稻不會產(chǎn)生影響土壤氨氧化細菌群落組成和豐度的生態(tài)風險。

此外，由于土壤中微生物種類繁多、數(shù)量龐大等多樣性特征有利于保證其群落的相對穩(wěn)定，使得轉(zhuǎn)基因作物種植對土壤微生物多樣性的干擾可能在一定時期內(nèi)不會表現(xiàn)。因此仍需要通過長期定位試驗進一步監(jiān)測種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對土壤各類微生物多樣性及其生態(tài)功能的影響，從而綜合評價種植抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性。

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