符美英，芮 凱，肖彤斌，黃偉明，陳綿才

海南省農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與植物保護研究所，海南省植物病蟲害防控重點實驗室，海南?？?71100

根結線蟲Meloidogyne spp.是一類在經(jīng)濟上極為重要的植物專性寄生線蟲，廣泛分布于世界各地，在35°S與35°N之間的地區(qū)分布最多(汪來發(fā)等，2001)。目前已報道有90多個種，但Karssen et al.(1999)認為僅81個為有效種。根結線蟲可寄生2000多種植物，是普遍且重要的農作物病原線蟲，一般造成農作物減產10% ～20%，嚴重的達75%以上。

海南島是我國唯一的熱帶陸海海域省份，氣候條件優(yōu)越，一年四季均適合農作物的生長。隨著熱帶現(xiàn)代農業(yè)的產業(yè)化發(fā)展，農作物復種指數(shù)不斷提高，根結線蟲病發(fā)生與危害日趨嚴重，給農作物的產量和品質造成較大影響，已成為制約熱帶特色現(xiàn)代農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙因子。

在根結線蟲的形態(tài)學分類中，會陰花紋一直被認為最具有應用價值(趙洪海，1999)。但由于一些種類個體間會陰花紋變異較大，如果僅憑此特征作為鑒定依據(jù)，可能導致鑒定誤差(卓侃等，2008)?；诟Y線蟲同工酶特別是酯酶和蘋果酸脫氫酶譜型的穩(wěn)定性，將其應用于根結線蟲分類鑒定已越來越受到植物線蟲學者的重視和關注。近年來，分子生物學技術作為一種輔助手段也廣泛應用于根結線蟲的分類鑒定中。Powers et al.(1993)用PCR技術研究了南方根結線蟲M.incongnita Kofoid et White等8種根結線蟲的線粒體DNA(mtDNA)，得到了不同大小的擴增片段，一些不能區(qū)分的片段，則通過進一步酶切鑒定。ITS(intemal transeribed spacer region)是一個通用的遺傳標記，被廣泛應用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹、預測種群結構、評估種群進化過程，以及確定分類地位等方面。廖金鈴(2001)對根結線蟲核糖體DNA的ITS區(qū)進行研究，通過分析熒光AFLP片段和對18S DNA、ITS區(qū)、26S DNA進行擴增、克隆與測序，成功地鑒定出花生根結線蟲M.arenaria(Neal)Chitwood、南方根結線蟲、瓜哇根結線蟲M.javanica Treub和最近描述的一個新種番禺根結線蟲M.panyuensis Liao。

象耳豆根結線蟲是一種重要的植物病原線蟲，現(xiàn)已廣泛分布于世界四大洲的熱帶亞熱帶地區(qū)，歐洲及地中海植物保護組織(EPPO)已將其列入檢疫名單。我國當前僅在海南省和廣東省發(fā)現(xiàn)該蟲(卓侃等，2008)，且國內關于象耳豆根結線蟲的報道也較少。據(jù)此，筆者試圖運用形態(tài)學、酯酶表型和分子生物學方法對海南島象耳豆根結線蟲進行全面而準確的鑒定，并對其分子特征加以分析，旨在為今后開展進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試病原根結線蟲采集于海南島各主要農作物主產區(qū)，分別將單卵塊接種于預先用消毒土培植的感病品種番茄根上，進行活體保存，待用。

1.2 形態(tài)學鑒定

1.2.1 雌蟲主要形態(tài)特征觀察 觀察頭部、尾部特征等，每個種群共觀測20頭。主要測計指標為體長、最大體寬、口針長、DGO(背食道腺開口至口針基部球的距離)、口針基部球高、口針基部球寬、中食道球長、中食道球寬。

1.2.2 2齡幼蟲(J2)形態(tài)觀察及測量 主要觀察頭部和尾部特征，每個種群共觀測20頭。測計指標除了1.2.1中涉及的指標外，還包括尾長、透明尾長和a值(體長/最大體寬)。

1.2.3 會陰花紋的制作與觀察 用挑針在體視顯微鏡下解剖根結，每個種群挑取成熟雌蟲20頭移入硬塑料板上的清水滴中，修切后剔除雜物，并用清水清洗3次;然后將包含完整會陰花紋的角質膜轉移到載玻片上，加蓋玻片;干燥后在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征并拍照。

1.3 同工酶分析

運用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行同工酶分析。電泳分析采用北京六一儀器廠生產的DYY-6B型電泳儀，7%分離膠和4%濃縮膠，每孔加入20頭純化培養(yǎng)的年輕雌蟲酶提取物。酯酶染色參照胡凱基(1988)的方法。以已鑒定的爪哇根結線蟲樣本作為參照系。酯酶表型的命名按照Esbenshade＆Triantaphyllou(1985)的方法。

1.4 DNA 的提取

參照萬新龍等(2007)的方法稍做改進，用挑針將單頭根結線蟲雌蟲從根結中挑出，放入200 μL的PCR管中，加入8 μL滅菌水，并用槍頭將線蟲蟲體戳破，直至內含物溢出;再加入2 μL 5×裂解buffer(10 × PCR buffer與1000 μg·mL－1蛋白酶 K，按等體積比混合);將PCR管轉移到－70℃冰箱中，冷凍30 min;將冷凍后的PCR管置于PCR儀中，65℃ 1 h，95℃ 10 min;掌上離心機瞬時離心后，取上清液用于PCR擴增或置于－20℃冰箱中備用。

1.5 mtDNA PCR 擴增

采用引物#C2F3(5'-GGTCAATGTCAGAAATTTGTGG-3')和#1108(5'-TACCTTTGACCAATCACGCT-3')對根結線蟲mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列進行擴增(黃偉明等，2011)。反應總體系為25 μL，引物各 1.0 μL，Perfectshot Ex Taq 12.5 μL(大連寶生物)，模板 DNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。反應參數(shù):94℃預變性4 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。

取10 μL PCR產物在濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上檢測所擴增片段的大小，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.6 rDNA-ITS 序列擴增

采用Vrain et al.(1992)設計的18S和28S引物(由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)，其序列分別為:5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'和5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'，對根結線蟲的rDNA-ITS進行擴增。反應總體系為25 μL，引物各 1.0 μL，Perfectshot Ex Taq 12.5 μL(大連寶生物工程有限公司)，模板 DNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。反應參數(shù):94℃預變性4 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴增片段大小的檢測方法與1.5一致。

1.7 PCR產物的克隆、測序與比對分析

對獲得的mtDNA和ITS條帶進行回收，將純化后的PCR產物與pGEM-T Easy Vector載體(Promega)于4℃下連接12 h以上后，采用熱擊法轉化到E.coli DH5a感受態(tài)細胞中。在含有氨芐Ampicillin(100 mg·L－1)、IPTG(24 mg·L－1)和 X-gal(20 mg·L－1)的LB篩選平板上挑取單個白色菌落于含有氨芐(100 mg·L－1)的液體LB中搖菌過夜。采用質粒提取試劑盒(OMEGA)提取重組質粒DNA，經(jīng)PCR鑒定后，篩選出含有正確插入片段的重組克隆進行測序(上海生工生物工程技術服務有限公司)。采用MEGA軟件包中的Neighbor-Joining聚類分析法對所測定的序列進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定

2.1.1 觀測值 通過顯微鏡觀察，對采自海南島的10個純化種群進行初步的會陰花紋觀察和形態(tài)學測量、比對。雌蟲呈梨形或球形，無后端突;頭區(qū)和頸區(qū)分界不明顯，唇盤圓盤狀;口針細，略向背面彎曲;基部球粗大。J2線形，頭區(qū)與蟲體有明顯的分界線。初步鑒定為象耳豆根結線蟲。詳細測量數(shù)據(jù)見表1。

2.1.2 會陰花紋特征 10個根結線蟲種群會陰花紋的主要特征較一致，主要表現(xiàn)在整體呈卵圓形到橢圓形，背弓較高，線紋較細、由平滑到波浪狀，尾尖區(qū)環(huán)紋不規(guī)則，側線不明顯(圖1)。與劉昊等(2005)描述的象耳豆根結線蟲會陰花紋形態(tài)一致。

2.2 同工酶鑒定

對各種群年輕雌蟲的酯酶進行電泳分析，并參照Esbenshade＆Triantaphyllou(1985)的方法分類，發(fā)現(xiàn)10個種群(表2)的酯酶譜型均為VS1-S1型，其中1SG和4HBJ種群的酯酶圖譜見圖2。結合形態(tài)學結果，進一步確認10個根結線蟲種群均為象耳豆根結線蟲。

表1 象耳豆根結線蟲的形態(tài)學測量數(shù)據(jù)Table 1 Measure data for morphology of M.enterolobii

圖1 象耳豆根結線蟲會陰花紋Fig.1 Perineal patterns of M.enterolobii

表2 象耳豆根結線蟲10個種群的酯酶譜型Table 2 Phenotypes of esterases for 10 different populations of M.enterolobii

圖2 象耳豆根結線蟲酯酶電泳圖Fig.2 Phenotypes of esterases for M.enterolobii in comparison with M.javanica.

2.3 mtDNA-PCR 擴增結果

用引物#C2F3和#1108對表1中10個根結線蟲種群mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列進行擴增，均可獲得700 bp的條帶(圖3)。這與有關文獻報道的象耳豆根結線蟲一致。

2.4 rDNA-ITS-PCR 擴增結果

用引物18S和28S擴增rDNA的ITS區(qū)序列，10個根結線蟲種群的ITS片段均為750 bp左右(圖4)。

2.5 序列測定與分析

對4HBJ種群的mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列和rDNA-ITS區(qū)序列分別進行克隆與測序，得到大小為705和765 bp的片段，將測序結果與Gen-Bank中已有的DNA序列進行同源性比較。發(fā)現(xiàn)與4HBJ種群mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列同源性最高的是象耳豆根結線蟲(GQ870255.1)，達100%。比對結果進一步證明4HBJ種群為象耳豆根結線蟲。與4HBJ種群的rDNA-ITS區(qū)序列同源性最高的也是象耳豆根結線蟲(JF309153.1)，為98%;而與南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲的同源性僅為88%左右(圖5)。

圖3 10個根結線蟲種群mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列PCR擴增結果Fig.3 PCR amplified mtDNA between COⅡ and LRNA for 10 populations of root-knot nematodes

圖4 10個根結線蟲種群rDNA-ITS區(qū)序列PCR擴增結果Fig.4 PCR amplified results of rDNA-ITS for 10 populations of root-knot nematodes

圖5 4HBJ種群rDNA-ITS區(qū)序列的聚類分析Fig.5 The clustering analysis of rDNA-ITS of 4HBJ population

3 討論

本研究運用形態(tài)學、同工酶電泳和 mtDNAPCR技術相結合的方法，準確鑒定出海南島農作物上的象耳豆根結線蟲。楊寶君(1983)于海南省儋州市野生象耳豆樹上發(fā)現(xiàn)象耳豆根結線蟲并鑒定為新種。本研究首次于海南島栽培的葫蘆科蔬菜(苦瓜、絲瓜、南瓜、黃瓜、葫蘆瓜)、辣椒和南藥植物(海巴戟、沉香、丁香)上發(fā)現(xiàn)該線蟲。

4HBJ種群mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列與Genbank上公布的象耳豆根結線蟲(GQ870255.1)的同源性高達100%，可以確定該種群為象耳豆根結線蟲。

常見根結線蟲種類如南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲的rDNA-ITS區(qū)差異很小，有報道認為這一分子特征不能用于常見根結線蟲的種類鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)，4HBJ種群的rDNA-ITS區(qū)序列與象耳豆根結線蟲(JF309153.1)的同源性高達98%，而與南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲的同源性僅為88%左右。這表明象耳豆根結線蟲rDNA-ITS區(qū)序列測定比對可作為其鑒定的1種方法，也闡明了象耳豆根結線蟲與其他常見根結線蟲種類的遺傳距離相對較遠，對于進一步開展象耳豆根結線蟲研究具有重要參考價值。

胡凱基.1988.酯酶在根結線蟲分類上應用的研究.林業(yè)科學研究，(6):650－656.

黃偉明，陳綿才，肖彤斌，王會芳，徐建華.2011.海南島葫蘆科蔬菜根結線蟲種類鑒定.植物保護，37(1):70－73.

廖金鈴.2001.根結線蟲的鑒定及其DNA多態(tài)性研究.廣州:華南農業(yè)大學.

劉昊，龍海，鄢小寧，崔汝強，李迅東，王彬，周健勇.2005.海南島番石榴根結線蟲病病原的種類鑒定及其寄主范圍的測試.南京農業(yè)大學學報，28(4):55－59.

萬新龍，李建洪，彭德良.2007.根結線蟲rDNA-ITS片段的克隆與序列分析.華中農業(yè)大學學報，26(5):624－628.

汪來發(fā)，楊寶君，李傳道.2001.華東地區(qū)根結線蟲的調查.林業(yè)科學研究，14(5):484－489.

楊寶君.1984.十五種根結線蟲病害的病原鑒定.植物病理學報，14(2):107－112.

趙洪海.1999.中國部分地區(qū)根結線蟲的種類鑒定和四種最常見種的種內形態(tài)變異研究.沈陽:沈陽農業(yè)大學.

卓侃，胡茂秀，廖金鈴，崔汝強，李迅東，王彬，周健勇.2008.廣東省和海南省象耳根結線蟲的鑒定.華中農業(yè)大學學報，27(2):193－197.

Esbenshade P R and Triantaphyllou A C.1985.Use of enzyme phonotype for indentification of Meloidogyne species.Journal of Nematology，17:6－20.

Karssen G.1999.The Plant-parasitic Nematode Genus Meloidogyne G?ldi，1892(Tylenchida)in Europe.The Netherlands，Gent Belgium:Gent University.

Power T O and Harris T S.1993.A polymerase chain reaction method for five major Meloidogyne species.Journal of Nematology，25(1):1 －6.

Vrain T C，Wakarchuk D A，Levesque A C and Hamilton R I.1992.Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group.Fundamental and Applied Nematology，15(6):563－573.