符美英，芮 凱，肖彤斌，黃偉明，陳綿才

海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南省植物病蟲害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口571100

根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.是一類在經(jīng)濟(jì)上極為重要的植物專性寄生線蟲，廣泛分布于世界各地，在35°S與35°N之間的地區(qū)分布最多(汪來發(fā)等，2001)。目前已報(bào)道有90多個種，但Karssen et al.(1999)認(rèn)為僅81個為有效種。根結(jié)線蟲可寄生2000多種植物，是普遍且重要的農(nóng)作物病原線蟲，一般造成農(nóng)作物減產(chǎn)10% ～20%，嚴(yán)重的達(dá)75%以上。

海南島是我國唯一的熱帶陸海海域省份，氣候條件優(yōu)越，一年四季均適合農(nóng)作物的生長。隨著熱帶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，農(nóng)作物復(fù)種指數(shù)不斷提高，根結(jié)線蟲病發(fā)生與危害日趨嚴(yán)重，給農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成較大影響，已成為制約熱帶特色現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙因子。

在根結(jié)線蟲的形態(tài)學(xué)分類中，會陰花紋一直被認(rèn)為最具有應(yīng)用價(jià)值(趙洪海，1999)。但由于一些種類個體間會陰花紋變異較大，如果僅憑此特征作為鑒定依據(jù)，可能導(dǎo)致鑒定誤差(卓侃等，2008)?；诟Y(jié)線蟲同工酶特別是酯酶和蘋果酸脫氫酶譜型的穩(wěn)定性，將其應(yīng)用于根結(jié)線蟲分類鑒定已越來越受到植物線蟲學(xué)者的重視和關(guān)注。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)作為一種輔助手段也廣泛應(yīng)用于根結(jié)線蟲的分類鑒定中。Powers et al.(1993)用PCR技術(shù)研究了南方根結(jié)線蟲M.incongnita Kofoid et White等8種根結(jié)線蟲的線粒體DNA(mtDNA)，得到了不同大小的擴(kuò)增片段，一些不能區(qū)分的片段，則通過進(jìn)一步酶切鑒定。ITS(intemal transeribed spacer region)是一個通用的遺傳標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、預(yù)測種群結(jié)構(gòu)、評估種群進(jìn)化過程，以及確定分類地位等方面。廖金鈴(2001)對根結(jié)線蟲核糖體DNA的ITS區(qū)進(jìn)行研究，通過分析熒光AFLP片段和對18S DNA、ITS區(qū)、26S DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆與測序，成功地鑒定出花生根結(jié)線蟲M.arenaria(Neal)Chitwood、南方根結(jié)線蟲、瓜哇根結(jié)線蟲M.javanica Treub和最近描述的一個新種番禺根結(jié)線蟲M.panyuensis Liao。

象耳豆根結(jié)線蟲是一種重要的植物病原線蟲，現(xiàn)已廣泛分布于世界四大洲的熱帶亞熱帶地區(qū)，歐洲及地中海植物保護(hù)組織(EPPO)已將其列入檢疫名單。我國當(dāng)前僅在海南省和廣東省發(fā)現(xiàn)該蟲(卓侃等，2008)，且國內(nèi)關(guān)于象耳豆根結(jié)線蟲的報(bào)道也較少。據(jù)此，筆者試圖運(yùn)用形態(tài)學(xué)、酯酶表型和分子生物學(xué)方法對海南島象耳豆根結(jié)線蟲進(jìn)行全面而準(zhǔn)確的鑒定，并對其分子特征加以分析，旨在為今后開展進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試病原根結(jié)線蟲采集于海南島各主要農(nóng)作物主產(chǎn)區(qū)，分別將單卵塊接種于預(yù)先用消毒土培植的感病品種番茄根上，進(jìn)行活體保存，待用。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.1 雌蟲主要形態(tài)特征觀察 觀察頭部、尾部特征等，每個種群共觀測20頭。主要測計(jì)指標(biāo)為體長、最大體寬、口針長、DGO(背食道腺開口至口針基部球的距離)、口針基部球高、口針基部球?qū)?、中食道球長、中食道球?qū)挕?/p>

1.2.2 2齡幼蟲(J2)形態(tài)觀察及測量 主要觀察頭部和尾部特征，每個種群共觀測20頭。測計(jì)指標(biāo)除了1.2.1中涉及的指標(biāo)外，還包括尾長、透明尾長和a值(體長/最大體寬)。

1.2.3 會陰花紋的制作與觀察 用挑針在體視顯微鏡下解剖根結(jié)，每個種群挑取成熟雌蟲20頭移入硬塑料板上的清水滴中，修切后剔除雜物，并用清水清洗3次;然后將包含完整會陰花紋的角質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到載玻片上，加蓋玻片;干燥后在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征并拍照。

1.3 同工酶分析

運(yùn)用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行同工酶分析。電泳分析采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6B型電泳儀，7%分離膠和4%濃縮膠，每孔加入20頭純化培養(yǎng)的年輕雌蟲酶提取物。酯酶染色參照胡凱基(1988)的方法。以已鑒定的爪哇根結(jié)線蟲樣本作為參照系。酯酶表型的命名按照Esbenshade＆Triantaphyllou(1985)的方法。

1.4 DNA 的提取

參照萬新龍等(2007)的方法稍做改進(jìn)，用挑針將單頭根結(jié)線蟲雌蟲從根結(jié)中挑出，放入200 μL的PCR管中，加入8 μL滅菌水，并用槍頭將線蟲蟲體戳破，直至內(nèi)含物溢出;再加入2 μL 5×裂解buffer(10 × PCR buffer與1000 μg·mL－1蛋白酶 K，按等體積比混合);將PCR管轉(zhuǎn)移到－70℃冰箱中，冷凍30 min;將冷凍后的PCR管置于PCR儀中，65℃ 1 h，95℃ 10 min;掌上離心機(jī)瞬時離心后，取上清液用于PCR擴(kuò)增或置于－20℃冰箱中備用。

1.5 mtDNA PCR 擴(kuò)增

采用引物#C2F3(5'-GGTCAATGTCAGAAATTTGTGG-3')和#1108(5'-TACCTTTGACCAATCACGCT-3')對根結(jié)線蟲mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列進(jìn)行擴(kuò)增(黃偉明等，2011)。反應(yīng)總體系為25 μL，引物各 1.0 μL，Perfectshot Ex Taq 12.5 μL(大連寶生物)，模板 DNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。

取10 μL PCR產(chǎn)物在濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上檢測所擴(kuò)增片段的大小，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.6 rDNA-ITS 序列擴(kuò)增

采用Vrain et al.(1992)設(shè)計(jì)的18S和28S引物(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，其序列分別為:5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'和5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'，對根結(jié)線蟲的rDNA-ITS進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25 μL，引物各 1.0 μL，Perfectshot Ex Taq 12.5 μL(大連寶生物工程有限公司)，模板 DNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性4 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增片段大小的檢測方法與1.5一致。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆、測序與比對分析

對獲得的mtDNA和ITS條帶進(jìn)行回收，將純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector載體(Promega)于4℃下連接12 h以上后，采用熱擊法轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。在含有氨芐Ampicillin(100 mg·L－1)、IPTG(24 mg·L－1)和 X-gal(20 mg·L－1)的LB篩選平板上挑取單個白色菌落于含有氨芐(100 mg·L－1)的液體LB中搖菌過夜。采用質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA)提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定后，篩選出含有正確插入片段的重組克隆進(jìn)行測序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。采用MEGA軟件包中的Neighbor-Joining聚類分析法對所測定的序列進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1 觀測值 通過顯微鏡觀察，對采自海南島的10個純化種群進(jìn)行初步的會陰花紋觀察和形態(tài)學(xué)測量、比對。雌蟲呈梨形或球形，無后端突;頭區(qū)和頸區(qū)分界不明顯，唇盤圓盤狀;口針細(xì)，略向背面彎曲;基部球粗大。J2線形，頭區(qū)與蟲體有明顯的分界線。初步鑒定為象耳豆根結(jié)線蟲。詳細(xì)測量數(shù)據(jù)見表1。

2.1.2 會陰花紋特征 10個根結(jié)線蟲種群會陰花紋的主要特征較一致，主要表現(xiàn)在整體呈卵圓形到橢圓形，背弓較高，線紋較細(xì)、由平滑到波浪狀，尾尖區(qū)環(huán)紋不規(guī)則，側(cè)線不明顯(圖1)。與劉昊等(2005)描述的象耳豆根結(jié)線蟲會陰花紋形態(tài)一致。

2.2 同工酶鑒定

對各種群年輕雌蟲的酯酶進(jìn)行電泳分析，并參照Esbenshade＆Triantaphyllou(1985)的方法分類，發(fā)現(xiàn)10個種群(表2)的酯酶譜型均為VS1-S1型，其中1SG和4HBJ種群的酯酶圖譜見圖2。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果，進(jìn)一步確認(rèn)10個根結(jié)線蟲種群均為象耳豆根結(jié)線蟲。

表1 象耳豆根結(jié)線蟲的形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)Table 1 Measure data for morphology of M.enterolobii

圖1 象耳豆根結(jié)線蟲會陰花紋Fig.1 Perineal patterns of M.enterolobii

表2 象耳豆根結(jié)線蟲10個種群的酯酶譜型Table 2 Phenotypes of esterases for 10 different populations of M.enterolobii

圖2 象耳豆根結(jié)線蟲酯酶電泳圖Fig.2 Phenotypes of esterases for M.enterolobii in comparison with M.javanica.

2.3 mtDNA-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

用引物#C2F3和#1108對表1中10個根結(jié)線蟲種群mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列進(jìn)行擴(kuò)增，均可獲得700 bp的條帶(圖3)。這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的象耳豆根結(jié)線蟲一致。

2.4 rDNA-ITS-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

用引物18S和28S擴(kuò)增rDNA的ITS區(qū)序列，10個根結(jié)線蟲種群的ITS片段均為750 bp左右(圖4)。

2.5 序列測定與分析

對4HBJ種群的mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列和rDNA-ITS區(qū)序列分別進(jìn)行克隆與測序，得到大小為705和765 bp的片段，將測序結(jié)果與Gen-Bank中已有的DNA序列進(jìn)行同源性比較。發(fā)現(xiàn)與4HBJ種群mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列同源性最高的是象耳豆根結(jié)線蟲(GQ870255.1)，達(dá)100%。比對結(jié)果進(jìn)一步證明4HBJ種群為象耳豆根結(jié)線蟲。與4HBJ種群的rDNA-ITS區(qū)序列同源性最高的也是象耳豆根結(jié)線蟲(JF309153.1)，為98%;而與南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲的同源性僅為88%左右(圖5)。

圖3 10個根結(jié)線蟲種群mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplified mtDNA between COⅡ and LRNA for 10 populations of root-knot nematodes

圖4 10個根結(jié)線蟲種群rDNA-ITS區(qū)序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplified results of rDNA-ITS for 10 populations of root-knot nematodes

圖5 4HBJ種群rDNA-ITS區(qū)序列的聚類分析Fig.5 The clustering analysis of rDNA-ITS of 4HBJ population

3 討論

本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)、同工酶電泳和 mtDNAPCR技術(shù)相結(jié)合的方法，準(zhǔn)確鑒定出海南島農(nóng)作物上的象耳豆根結(jié)線蟲。楊寶君(1983)于海南省儋州市野生象耳豆樹上發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲并鑒定為新種。本研究首次于海南島栽培的葫蘆科蔬菜(苦瓜、絲瓜、南瓜、黃瓜、葫蘆瓜)、辣椒和南藥植物(海巴戟、沉香、丁香)上發(fā)現(xiàn)該線蟲。

4HBJ種群mtDNA的COⅡ和LRNA基因間序列與Genbank上公布的象耳豆根結(jié)線蟲(GQ870255.1)的同源性高達(dá)100%，可以確定該種群為象耳豆根結(jié)線蟲。

常見根結(jié)線蟲種類如南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的rDNA-ITS區(qū)差異很小，有報(bào)道認(rèn)為這一分子特征不能用于常見根結(jié)線蟲的種類鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)，4HBJ種群的rDNA-ITS區(qū)序列與象耳豆根結(jié)線蟲(JF309153.1)的同源性高達(dá)98%，而與南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的同源性僅為88%左右。這表明象耳豆根結(jié)線蟲rDNA-ITS區(qū)序列測定比對可作為其鑒定的1種方法，也闡明了象耳豆根結(jié)線蟲與其他常見根結(jié)線蟲種類的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，對于進(jìn)一步開展象耳豆根結(jié)線蟲研究具有重要參考價(jià)值。

胡凱基.1988.酯酶在根結(jié)線蟲分類上應(yīng)用的研究.林業(yè)科學(xué)研究，(6):650－656.

黃偉明，陳綿才，肖彤斌，王會芳，徐建華.2011.海南島葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲種類鑒定.植物保護(hù)，37(1):70－73.

廖金鈴.2001.根結(jié)線蟲的鑒定及其DNA多態(tài)性研究.廣州:華南農(nóng)業(yè)大學(xué).

劉昊，龍海，鄢小寧，崔汝強(qiáng)，李迅東，王彬，周健勇.2005.海南島番石榴根結(jié)線蟲病病原的種類鑒定及其寄主范圍的測試.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，28(4):55－59.

萬新龍，李建洪，彭德良.2007.根結(jié)線蟲rDNA-ITS片段的克隆與序列分析.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，26(5):624－628.

汪來發(fā)，楊寶君，李傳道.2001.華東地區(qū)根結(jié)線蟲的調(diào)查.林業(yè)科學(xué)研究，14(5):484－489.

楊寶君.1984.十五種根結(jié)線蟲病害的病原鑒定.植物病理學(xué)報(bào)，14(2):107－112.

趙洪海.1999.中國部分地區(qū)根結(jié)線蟲的種類鑒定和四種最常見種的種內(nèi)形態(tài)變異研究.沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué).

卓侃，胡茂秀，廖金鈴，崔汝強(qiáng)，李迅東，王彬，周健勇.2008.廣東省和海南省象耳根結(jié)線蟲的鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，27(2):193－197.

Esbenshade P R and Triantaphyllou A C.1985.Use of enzyme phonotype for indentification of Meloidogyne species.Journal of Nematology，17:6－20.

Karssen G.1999.The Plant-parasitic Nematode Genus Meloidogyne G?ldi，1892(Tylenchida)in Europe.The Netherlands，Gent Belgium:Gent University.

Power T O and Harris T S.1993.A polymerase chain reaction method for five major Meloidogyne species.Journal of Nematology，25(1):1 －6.

Vrain T C，Wakarchuk D A，Levesque A C and Hamilton R I.1992.Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group.Fundamental and Applied Nematology，15(6):563－573.