鄭思道，吳紅金，劉宇娜

MicroRNA（miRNA）是一種長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA，本身不編碼蛋白質(zhì)，但能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，屬于表觀遺傳學(xué)范疇［1］。人體大約有1 000余種miRNA，這些miRNA可以調(diào)控20%～30%的基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)人體生長(zhǎng)、發(fā)育、生理和病理等過程［2］。對(duì)miRNA表達(dá)譜的分析可以用于發(fā)現(xiàn)新生物標(biāo)志物，而對(duì)miRNA干擾技術(shù)的研究則能夠用于發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)作用的新靶點(diǎn)、新途徑和新機(jī)制［3－5］。

基于miRNA研究技術(shù)的完善和成熟，中藥治療作用的miRNA機(jī)制研究將會(huì)逐漸獲得關(guān)注。綜合相關(guān)研究，本文在分析目前中藥及其活性成分調(diào)節(jié)miRNA研究的基礎(chǔ)上，對(duì)miRNA在中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的作用和意義進(jìn)行探討。

1 miRNA的發(fā)現(xiàn)、理論形成和研究方法

miRNA由Lee研究小組于1993年對(duì)秀麗隱桿線蟲的研究中首次發(fā)現(xiàn)［6］。隨后的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在果蠅、蠕蟲和人類體內(nèi)也存在miRNA，該類分子可以與靶基因3’非編碼區(qū)（3’－Untranslated Region，3’－UTR）結(jié)合，下調(diào)靶基因表達(dá)水平［7］。在對(duì)miRNA的研究過程中逐漸形成了其對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的經(jīng)典學(xué)說：由內(nèi)含子或多順反子轉(zhuǎn)錄本首先轉(zhuǎn)錄出初級(jí)miRNA，經(jīng)RNA酶Drosha處理后，形成70～100核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)樣miRNA前體，然后被輸出蛋白5從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，最終被Dicer酶切成成熟的miRNA鏈和與其互補(bǔ)的miRNA＊鏈，互補(bǔ)鏈很快降解，而成熟的miRNA則與RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物結(jié)合，通過抑制靶mRNA翻譯或促進(jìn)其降解下調(diào)基因表達(dá)［8］。

盡管miRNA對(duì)基因的調(diào)節(jié)作用和方式不完全相同，近年來逐漸形成了miRNA研究的通用模式。Evavan Rooij對(duì)此進(jìn)行了總結(jié)，首先進(jìn)行miRNA表達(dá)篩選，主要應(yīng)用miRNA芯片篩選、深度測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Real－Time Polymerase Chain Reaction，qRT－PCR）、RNA印跡和原位雜交等技術(shù)；其次對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行確證，主要應(yīng)用生物信息分析、UTR分析、轉(zhuǎn)錄組／蛋白組分析和pull－down研究等技術(shù)；最后進(jìn)行miRNA干預(yù)研究，主要應(yīng)用離體miRNA調(diào)節(jié)、基因miRNA調(diào)節(jié)、在體miRNA抑制和在體miRNA模擬等技術(shù)［8］。

2 中藥及其活性成分對(duì)miRNA的調(diào)節(jié)作用

2.1 對(duì)腫瘤相關(guān)miRNA的調(diào)節(jié) miR－15a和miR－16姜黃素（Curcumin）是姜黃中的一種多元酚，可以與組蛋白脫乙酰酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和miRNA結(jié)合，具有調(diào)節(jié)表觀遺傳信息的作用［9］。有研究表明，姜黃素可以通過miR－15a和miR－16介導(dǎo)對(duì)Bcl－2的調(diào)控，顯示出抗腫瘤作用：在姜黃素處理的人乳腺癌MCF－7細(xì)胞中miR－15a和miR－16表達(dá)上調(diào)，Bcl－2表達(dá)下調(diào)；應(yīng)用抑制劑下調(diào)miR－15a和miR－16表達(dá)水平時(shí)，Bcl－2的表達(dá)恢復(fù)［10］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin Gallate）是綠茶多酚的主要活性成分之一，研究顯示該分子能夠上調(diào)肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞中13個(gè)miRNA、下調(diào)48個(gè)miRNA，其中被上調(diào)的miR－16可以通過抑制靶基因Bcl－2表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯示抗腫瘤作用［11］。2.1.1 miR－21和miR－200 吉西他濱治療胰腺癌的藥物敏感性可以被姜黃素或其類似物調(diào)節(jié)，這一作用由上調(diào)的miR－200和下調(diào)的miR－21介導(dǎo)：miR－21的下調(diào)引起第十號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶－張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome Ten，PTEN）表達(dá)的增加，而PTEN是抑癌基因之一；miR－200的上調(diào)則介導(dǎo)藥物治療敏感性的增強(qiáng)［12］。近期研究證實(shí)，姜黃素呈劑量依賴性抑制激活蛋白1（activator protein 1，AP－1）與 miR－21轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的結(jié)合，降低miR－21的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而提高其靶基因程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell Death 4，PDCD4）的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用［13］。中藥王不留行的活性單體鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl Phthalate，DBP）也具有下調(diào)miR－21表達(dá)的作用：對(duì)泌乳中期奶牛乳腺上皮細(xì)胞中miRNA的調(diào)節(jié)作用與催乳素類似，均能下調(diào)miR－125、miR－143和miR－195的表水平，不同的是DBP對(duì)miR－21的表達(dá)具有明顯抑制作用，而催乳素對(duì)miR－21的影響尚不明確［14］。大豆異黃酮（Isoflavone）是大豆中的一種黃酮類化合物，與雌激素有相似結(jié)構(gòu)中，具有抗腫瘤作用［15］。研究顯示，大豆異黃酮能夠通過上調(diào)miR－200抑制胰腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、Slug基因和波形蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的表型改變，表明大豆異黃酮對(duì)miRNA的調(diào)節(jié)可能是其抗腫瘤的作用機(jī)制之一［16］。

2.1.2 miR－22 除miR－21和 miR－200以外，姜黃素也能夠上調(diào)胰腺細(xì)胞中miR－22表達(dá)水平，并下調(diào)miR－199a＊，其中miR－22的上調(diào)可以抑制胰腺癌PxBC－3細(xì)胞中的靶基因轉(zhuǎn)錄因子SP1和雌激素受體1表達(dá)，表明miR－22也介導(dǎo)了姜黃素的抗腫瘤作用［17］。

2.1.3 mi－128 人參皂苷（Ginsenoside，GSS）是人參的主要活性成分，現(xiàn)代研究表明人參具有抗腫瘤作用［18］。GSS Rh2（R型）能夠調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miRNA的表達(dá)（上調(diào)14個(gè)，下調(diào)12個(gè)），其中 miR－128在人膠質(zhì)瘤 U251、T98MG和A172等三個(gè)細(xì)胞系中的上調(diào)被qRT－PCR進(jìn)一步證實(shí)；而miR－128表達(dá)下調(diào)則降低GSS Rh2介導(dǎo)的半胱氨酸天冬氨酸酶3（Cysteine－Aspartic Protease 3，caspase－3）激活水平和靶基因E2F3a的蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞毒性作用，減少細(xì)胞凋亡［19］?？梢钥闯鰉iR－128介導(dǎo)了GSS Rh2對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.1.4 miR－146a 胰腺癌的高侵襲性與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過表達(dá)和核因子κB（Nuclear factorκB，NF－κB）的活化有關(guān)，伴有 miR－146a表達(dá)的下調(diào)；大豆異黃酮能夠通過上調(diào)miR－146a降低EGFR和白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（interleukin－1receptor－associated kinase 1，IRAK－1）的表達(dá)水平，而IRAK－1是NF－κB的調(diào)節(jié)酶，能夠調(diào)控其表達(dá)水平［20］。該研究表明miR－146a介導(dǎo)的EGFR和NF－κB表達(dá)抑制，是大豆異黃酮拮抗胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制之一。白藜蘆醇（Resveratrol）是虎杖的根莖提取物之一，也存在于某些葡萄的果皮中，被證實(shí)具有抗腫瘤作用［21］。較早的一篇研究表明，NF－κB敏感的miR－146a與補(bǔ)體因子 H（Complement Factor H，CFH）的3’－UTR互補(bǔ)，兩者結(jié)合后下調(diào)CFH表達(dá)，增強(qiáng)阿爾茨海默癥患者腦組織的炎癥反應(yīng)，而白藜蘆醇可以抑制miR－146a的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)［22］。

2.1.5 miR－186 姜黃素能夠通過下調(diào)耐順鉑人肺腺癌A549／DDP細(xì)胞株的miR－186表達(dá)水平加速細(xì)胞凋亡；轉(zhuǎn)染miR－186的類似物后，miR－186的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡減少，這一結(jié)果表明姜黃素可以通過下調(diào)miR－186促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是其治療腫瘤的作用機(jī)制之一［23］。該課題組的另一研究顯示，caspase－10可能是 miR－186的靶基因［24］。

2.1.6 miR－663 研究顯示，白藜蘆醇能夠上調(diào)人單核細(xì)胞白血病的miR－663表達(dá)水平，并通過其靶基因JunB和JunD下調(diào)AP－1表達(dá)，表明miR－663在白藜蘆醇的抗腫瘤機(jī)制中具有重要作用［25］。該課題組的另一研究也證實(shí)，白藜蘆醇能夠上調(diào)miR－633的表達(dá)，并下調(diào)靶基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）的表達(dá)水平，兩者結(jié)合位點(diǎn)在TGFβ1mRNA的3’－UTR［26］。該研究同時(shí)顯示，白藜蘆醇可以下調(diào)腸癌SW480細(xì)胞中腫瘤相關(guān)的其他miRNA，這些miRNA涉及對(duì)Dicer1、PDCD4和PTEN等的調(diào)節(jié)。2.1.7 其他miRNA 研究顯示，延胡索中的延胡索總生物堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞中的miRNA具有調(diào)節(jié)用，與抑制腫瘤增殖作用相關(guān)的miRNA包括下調(diào)的miR－221、miR－222和上調(diào)的miRNA let－7a［27］。另一對(duì)中藥復(fù)方的研究顯示，鼻咽癌細(xì)胞的增殖可以被復(fù)方小柴胡湯（半枝蓮、莪術(shù)、法夏）抑制，其作用機(jī)制涉及對(duì)miR－513、miR－498、miR－210miR－602的調(diào)節(jié)［28］。

2.2 對(duì)心血管疾病相關(guān)miRNA的調(diào)節(jié)

2.2.1 miR－1 丹參酮ⅡA（Tanshinone，ⅡA）是中藥丹參的活性成分之一，具有保護(hù)心肌和抗缺血性心律失常的功效［29，30］。楊寶峰等［31］對(duì)丹參酮抗缺血性心律失常的 miRNA機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，下調(diào)miR－1、升高Kir2.1可能是丹參酮ⅡA治療缺血性心律失常的作用機(jī)制之一。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，丹參酮ⅡA也可以抑制缺血及低氧條件下（98%N2＋2%O2）心肌細(xì)胞中p38絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen－Activated Protein Kinase，MAPK）介導(dǎo)的miR－1上調(diào)，逆轉(zhuǎn)其對(duì)縫隙連接蛋白43翻譯的抑制，從而保護(hù)缺血心肌［32］。

2.2.2 miR－21和miR－539 白藜蘆醇對(duì)缺血性心臟具有保護(hù)作用，涉及對(duì)心肌細(xì)胞多個(gè)miRNA的調(diào)節(jié)作用，其中的miR－21參與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶－ MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，與心肌纖維化密切相關(guān)；miR－539則通過靶基因包括基質(zhì)金屬肽酶20、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子14、網(wǎng)格蛋白、輕鏈多肽、骨保護(hù)素、轉(zhuǎn)錄因子類似物叉頭框B1等參與調(diào)節(jié)心肌重構(gòu)［33］。

2.2.3 miR－214 GSS Rg1可以調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞22個(gè)miRNA的表達(dá)水平，其中下調(diào)的miR－214被進(jìn)一步qRTPCR證實(shí)，其靶基因是內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），結(jié)合靶點(diǎn)位于eNOS mRNA 的3’－UTR，因而GSS Rg1通過miR－214的介導(dǎo)最終顯示出上調(diào)eNOS表達(dá)的作用，有利于促進(jìn)血管的生成［34］。

2.3 對(duì)代謝性疾病miRNA的調(diào)節(jié)

2.3.1 miR－34a 孫維峰等［35］應(yīng)用qRT－PCR芯片進(jìn)行的研究表明，泄?jié)岢苑剑ㄍ淋蜍?、萆薢、山慈菇、王不留行、牛膝）能夠調(diào)節(jié)腎臟組織的miRNA表達(dá)（上調(diào)5個(gè)，下調(diào)27個(gè)），改善高尿酸血癥。在被調(diào)節(jié)的miRNA中miR－34b－5p上調(diào)幅度最大，而miR－208下調(diào)幅度最大；該方呈劑量依賴性下調(diào)miR－122和上調(diào)miR－34a、miR－146，靶基因預(yù)測(cè)顯示，miR－34a的靶基因是尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子（urate transporter 1，URAT－1），進(jìn)一步細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi－34a類似物的研究證實(shí)，miR－34a能夠抑制URAT－1的表達(dá)。

對(duì)上述研究綜合分析發(fā)現(xiàn)，中藥活性成分可以特異性調(diào)節(jié)單個(gè)miRNA表達(dá)，也有可能同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)miRNA表達(dá)；特定miRNA的表達(dá)也可以被多種中藥活性成分調(diào)節(jié)（見表1）。

表1 中藥及其活性成分對(duì)miRNA的調(diào)節(jié)作用

3 中藥相關(guān)miRNA的研究意義

3.1 闡明中藥作用機(jī)制 中藥及其活性成分對(duì)miRNA具有廣泛調(diào)節(jié)作用，而miRNA對(duì)人體生理病理過程中具有重要調(diào)控作用?？梢酝茰y(cè)miRNA介導(dǎo)的治療作用是中藥取效的新機(jī)制之一，miRNA研究為中藥作用機(jī)制的探索開辟了全新領(lǐng)域。主要體現(xiàn)在可以通過miRNA表達(dá)譜、靶基因分析和miRNA干擾等技術(shù)確定中藥及其活性成分的人體miRNA靶標(biāo)，闡明特定中藥或中藥活性成分對(duì)人體特異miRNA的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而探索靶基因的調(diào)控作用和細(xì)胞功能，最終詳細(xì)繪制出中藥／中藥活性成分－miRNA－mNRA－蛋白質(zhì)－細(xì)胞功能－疾病治療的完成路線圖。這種方法不僅可以對(duì)單個(gè)分子層面進(jìn)行研究，也可以結(jié)合信息分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等多種技術(shù)分析多層面分子之間的聯(lián)系，促進(jìn)中藥作用機(jī)制研究的系統(tǒng)化、網(wǎng)絡(luò)化和整體化。更進(jìn)一步的研究可以將miRNA研究技術(shù)與中藥化學(xué)物質(zhì)組、基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)等研究方法結(jié)合起來，應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)的理念探索中藥的網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)和調(diào)節(jié)通路［36，37］。

另外，研究表明植物也含有miRNA，這些miRNA的結(jié)構(gòu)與人體miRNA相似但不完全相同，然而一些miRNA可以通過消化系統(tǒng)進(jìn)入人體，調(diào)控組織細(xì)胞功能［38］。這一發(fā)現(xiàn)提示miRNA也是中藥的活性成分之一，并且不同于以往中藥或中藥活性成分進(jìn)入人體調(diào)節(jié)其他分子的作用機(jī)制，中藥miRNA可以直接調(diào)節(jié)人體miRNA表達(dá)。無論是miRNA直接調(diào)節(jié)人體miRNA表達(dá)，還是中藥其他分進(jìn)入人體后間接調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)，對(duì)中藥及其活性成分miRNA調(diào)節(jié)作用的探索將極大推動(dòng)中藥作用機(jī)制研究。

3.2 創(chuàng)新傳統(tǒng)中藥新藥研發(fā) miRNA干擾技術(shù)不僅可以用于發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制研究，還可以作為研發(fā)新藥的新途徑。miRNA的類似物或拮抗劑可以通過調(diào)節(jié)特異性miRNA表達(dá)調(diào)控靶基因并最終影響細(xì)胞功能、干預(yù)疾病進(jìn)程［39，40］。中藥屬天然藥物，其活性成分也為自然存在，毒副反應(yīng)發(fā)生率低，具有較好的人體相容性。提取活性成分或應(yīng)用自身含有的miRNA進(jìn)行人體miRNA干預(yù)研究可以增加中藥新藥研發(fā)的成功率，并顯著降低研發(fā)成本和風(fēng)險(xiǎn)，是中藥新藥研發(fā)的優(yōu)選途徑之一。3.3 擴(kuò)展現(xiàn)代中醫(yī)藥理論 隨著研究方法的改進(jìn)和研究領(lǐng)域的擴(kuò)展，中醫(yī)藥理論也不斷豐富。miRNA的發(fā)現(xiàn)為現(xiàn)代中醫(yī)藥理論的發(fā)展提供了新的切入點(diǎn)。miRNA具有組織特異性［41］，是否可以結(jié)合歸經(jīng)理論探索中藥的靶向作用？miRNA也顯示出疾病特異性［42］，結(jié)合中醫(yī)辨證、辨病的特點(diǎn)，能否對(duì)中醫(yī)病證的表象和本質(zhì)進(jìn)行分析？miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因［43］，而中醫(yī)藥療疾治病具有整體觀，兩者的特性是否存在聯(lián)系？這些是中醫(yī)藥miRNA相關(guān)研究中值得關(guān)注的諸多問題中的一小部分，這類思考和探索將有助于促進(jìn)中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合理論的發(fā)展。

在中醫(yī)理論指導(dǎo)下對(duì)中醫(yī)藥miRNA相關(guān)進(jìn)行研究，對(duì)闡明中藥作用機(jī)制、創(chuàng)新中藥新藥研發(fā)和豐富現(xiàn)代中醫(yī)理論具有重要意義，值得深入探索和分析。

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