李爭光，吳 駿，吳昌平，蔣敬庭，魯 露，徐 斌，鄭 曉

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤中心，江蘇 常州 213003)

原發(fā)性肝癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居第3位，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康［1］。我國為肝癌高發(fā)區(qū)，每年肝癌死亡病例約占全球的50%。肝癌起病隱匿，許多患者就診時已是晚期，其生存期一般只有3～6個月。經(jīng)過近幾十年的努力，肝癌的診療雖然取得了巨大的進(jìn)步，但其總體療效仍不令人滿意，5 a生存率低于12%。魚藤素是一種天然的魚藤酮類化合物，在多種腫瘤細(xì)胞和動物模型中均證實具有較強(qiáng)的抗腫瘤及化療増敏作用，魚藤素在肝癌中的作用尚未見報道［2-5］。本研究觀測魚藤素對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的作用，并初步探索其作用機(jī)制，為魚藤素的進(jìn)一步研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 魚藤素、二甲亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、噻唑藍(lán)(MTT)購自Sigma-Aldrich公司，氟尿嘧啶購自天津金耀有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司，蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，抗總Akt(t-Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、GAPDH一抗購自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實驗中所用其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721為本實驗室保藏并常規(guī)傳代培養(yǎng)，生長于含有體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清，青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(100 g·L-1)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)3～4 d傳代1次，所有實驗采用對數(shù)生長期細(xì)胞。所用魚藤素首先溶于DMSO作為儲備液，然后稀釋于RPMI-1640培養(yǎng)基中作為工作液，保證工作液DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化成單個細(xì)胞懸液，每孔3～5×103細(xì)胞接種于96孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜后，每孔加入含不同濃度魚藤素(0～100 μmol·L-1)的RPMI-1640繼續(xù)孵育24～72 h，孵育48 h之后，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h。棄去上清后，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩搖勻，用酶標(biāo)儀于570 nm波長測定吸光度值。按照下列公式計算藥物對細(xì)胞的抑制率:抑制率(%)=［(對照組OD-實驗組OD)/對照組OD］×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳 采用1 μmol·L-1魚藤素處理細(xì)胞48 h后收集5×106個細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，重懸于適量裂解液5 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、體積分?jǐn)?shù)0.25%Nonidet P-40和1 mmol·L-1EDTA，加入無 DNA酶的 RNA酶 0.2 g·L-1，37℃水浴孵育1 h，再加入蛋白酶 K 0.3 g·L-1，37 ℃水浴孵育1 h，取20 μL 上清在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5% 瓊脂糖凝膠，50 V電壓下電泳2 h后觀察DNA ladder的形成。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化成單個細(xì)胞懸液，每孔1×104個細(xì)胞，接種于6孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜。細(xì)胞貼壁后，如上以1 μmol·L-1魚藤素處理72 h，體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇固定細(xì)胞后，以0.001 g·L-1的PI染色倒置熒光顯微鏡下觀察，同時未處理細(xì)胞為對照。

1.2.5 Western blot檢測蛋白水平 細(xì)胞如上以1 μmol·L-1魚藤素處理72 h后，收集1×107個細(xì)胞，按說明書以蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白定量試劑盒定量，與5×樣品緩沖液混合，煮沸5 min。將樣品每泳道20 μg在質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%SDS-聚丙烯凝膠中進(jìn)行電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。用封閉緩沖液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉，20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，體積分?jǐn)?shù) 0.1%Tween-20，pH 7.6)封閉1 h后，加入所需一抗4℃孵育過夜。TBS/T洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，ECL法顯色并曝光。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以ˉx±s表示計量數(shù)據(jù)，2組之間比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 魚藤素抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖 MTT實驗結(jié)果顯示(圖1)，魚藤素處理后可明顯抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖，隨著魚藤素濃度的增加，其抑制作用隨之增強(qiáng)，提示其作用呈劑量依賴性。各劑量組與對照組相比，相對細(xì)胞增殖抑制率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。隨魚藤素處理時間延長，其抑制作用隨之增強(qiáng)，以0.8 μmol·L-1魚藤素處理 24 、48、72 h，其抑制率分別為(21.4±6.5)%、(35.5±3.9)%、(41.9±2.2)%，可見其作用呈時間依賴性。

圖1 細(xì)胞活力分析結(jié)果

2.2 魚藤素誘導(dǎo) SMMC-7721細(xì)胞凋亡2 μmol·L-1魚藤素處理48 h后收集細(xì)胞，行DNA瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果處理后由大約180～200 bp的DNA片段形成典型的DNA ladder，說明魚藤素誘導(dǎo)了SMMC-7721細(xì)胞凋亡(圖2)。形態(tài)學(xué)觀測所見進(jìn)一步證實，與處理細(xì)胞相比，SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)1 μmol·L-1魚藤素處理72 h后，細(xì)胞總數(shù)、增殖分裂細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞增多(圖3)。

2.3 魚藤素對Akt的影響 Western blot檢測結(jié)果示魚藤素處理前后t-Akt水平無明顯變化，但SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)1 μmol·L-1魚藤素處理72 h后p-Akt水平較處理前明顯降低(圖4)。提示魚藤素不影響Akt的水平，但明顯抑制其磷酸化水平，從而抑制其活性。

3 討論

肝癌與其他大多數(shù)惡性腫瘤一樣，其發(fā)生發(fā)展不僅與細(xì)胞增殖有關(guān)，亦與細(xì)胞凋亡有關(guān)，故尋找有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的藥物，一直腫瘤治療研究的熱點［6-8］。

魚藤素是一種天然魚藤酮類化合物，最初被用作殺蟲劑，但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)魚藤素對惡性腫瘤有較強(qiáng)的預(yù)防和治療作用。本研究選用SMMC-7721細(xì)胞作為實驗細(xì)胞，在體外觀察了魚藤素的抗腫瘤作用，結(jié)果證實魚藤素可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，其作用呈時間和劑量依賴性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變、DNA瓊脂糖凝膠電泳梯形條帶的出現(xiàn)均表明魚藤素能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。魚藤素抗腫瘤的主要作用是通過下調(diào)Akt的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的［4］，本文結(jié)果再次證實了這一機(jī)制。PI3K/Akt信號通路在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、死亡、存活過程中發(fā)揮著重要作用，是潛在抗腫瘤治療靶點［9-11］。Akt活化后可以通過磷酸化作用調(diào)控下游靶蛋白 Bad、Caspase-9、NF-B、mTOR等，經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子［12］。魚藤素正是通過下調(diào)Akt的磷酸化水平抑制其活性，從而發(fā)揮作用的。

圖4 Western blot蛋白水平檢測結(jié)果

總之，魚藤素對SMMC-7721細(xì)胞有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，其作用機(jī)制與Akt磷酸化水平下調(diào)，活性抑制有關(guān)，但其深入作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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