李 瑛 王亞珠 范晉奇 殷躍輝

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心內科，重慶 400010)

越來越多的報道揭示了基因變異與房顫的關聯(lián)〔1，2〕，包括離子通道、結構重塑、心臟發(fā)育相關的基因〔3～6〕，這些致病基因主要通過對心房各種離子通道的結構和功能改變來影響房顫的發(fā)生或維持。在這些房顫的分子遺傳學研究中，參與早期心臟發(fā)育的基因與房顫的相關性卻少有報道。TBX5基因對早期心臟的正常發(fā)育起著至關重要的作用，TBX5基因變異可導致心房結構的形成和發(fā)育異常，影響心房的結構和功能，增加房顫發(fā)生的機會〔7〕。本研究通過對TBX5基因rs3825214位點單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的研究，探討TBX5基因rs3825214位點多態(tài)性與房顫的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2009年6月至2010年12月就診于我科門診和住院患者，房顫組100例和對照組107例。研究對象入選標準:房顫組:①年齡18～75歲，男女不限;②確診房顫，依據(jù)明確的心電圖或動態(tài)心電圖資料，以及明確的臨床癥狀和病史。對照組:選擇與病例組基礎臨床資料相匹配的同期住院患者，①年齡18～75歲，男女不限;②無房顫病史。排除標準:排除風濕性心臟瓣膜病、擴張型心肌病、肥厚型心肌病、病毒性心肌炎、繼發(fā)性高血壓、甲狀腺功能亢進、電解質紊亂、惡性腫瘤、肝腎功能不全等疾病。100例房顫病例和107例對照病例的臨床資料(表1)。兩組患者的性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史等一般資料無顯著差異(P＞0.05);在左右心房內徑上有顯著差異(表1)。

1.2 房顫組和對照組的基本特征檢測指標 性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙、飲酒、冠心病史、高血壓病史、糖尿病史等。

1.3 基因組DNA提取 采集所有入組病例外周靜脈血2 ml，用天根全血DNA提取試劑盒(DP318)提取全基因組DNA，-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因型檢測 采用巢氏聚合酶鏈反應(PCR)擴增含有目的位點的片段。PCR擴增反應體系為25μl，第一輪反應體系包括模板DNA 2μl，PCR預混試劑〔寶生物工程(大連)有限公司〕12.5μl，第一對引物上下游引物各20 pmol，加去離子水至25μl。第二輪反應體系包括模板2μl(第一輪PCR產物加水稀釋10倍)，PCR預混試劑12.5μl，第二對引物上下游引物各20 pmol，加去離子水至25μl。擴增反應在PCR熱循環(huán)儀(美國Bio-Rad公司)上完成。rs3825214位點設計引物如下:第一對上游引物:5'-TGGGTAGCTAAGAACTAAGATTGAG-3';下游引物:5'-GTTTCATTTTTCTTCACTTCTCCA-3';第二對上游引物:5'-TCCGTCAACATGAACTGCTCT-3';下游引物:5'-GATAAGTAATGAGTCTGTGTTGAGGT-3'〔生工生物工程(上海)有限公司合成〕;第一輪循環(huán)擴增參數(shù)為:95℃預變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共 40 個循環(huán);72℃延伸 6 min，4℃ 保存。第二輪循環(huán)擴增參數(shù)為:95℃預變性5 min;95℃ 25 s，59℃25 s，72℃ 35 s，共 35 個循環(huán);72℃ 延伸 6 min，4℃ 保存。PCR產物片段長度為160 bp。擴增產物用限制性內切酶 AluI ER0011〔生工生物工程(上海)有限公司合成〕消化。酶切反應總體積為20 μl，包括 PCR 產物10 μl，10×Buffer 2 μl，限制性內切酶1μl，加去離子水至20μl，酶切反應條件為37℃水浴過夜。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物，電泳緩沖液為1倍TAE，100 V電壓下電泳30 min。同時選擇部分病例的PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的DNA片段送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.5 統(tǒng)計學處理 計量資料用x±s表示，均行正態(tài)分布檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料用百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。單個基因型及組間等位基因頻率的比較采用χ2檢驗。Hardy-Weinberg吻合度檢驗判斷樣本基因頻率的可靠性。對臨床資料和基因多態(tài)性進行相關分析，采用Logistic多元回歸分析臨床資料和基因多態(tài)性與房顫的相關性，所有統(tǒng)計學處理由SPSS17.0統(tǒng)計軟件完成。

表1 兩組患者的臨床及輔助檢查基線資料(n，x±s)

2 結果

2.1 基因型分型 rs3825214位點PCR擴增產物片段長度為160 bp，經(jīng)限制性內切酶AluI消化，2%瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)三種不同的結果，分別為GG純合型(1條譜帶，160 bp)，AG雜合型(3條譜帶，160、111 bp和49 bp)和AA純合型(2條譜帶，111 bp和49 bp)。見圖1。rs3825214位點單核苷酸多態(tài)性測序結果見圖2。

圖1 rs3825214位點單核苷酸多態(tài)性PCR產物酶切電泳結果

2.2 基因型分布與房顫的關系 房顫組和對照組TBX5基因rs3825214位點均存在多態(tài)性改變(GG，AG和AA)，等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡性檢驗。房顫組和對照組間比較，GG，AG和AA的基因型分布存在顯著差異(P=0.001)。兩組間G和A等位基因頻率差異顯著(P=0.001)。見表2。

2.3 基因分型與房顫合并高血壓的關系 在房顫組中合并有高血壓的患者(44例)與不合并高血壓的患者(56例)的GG、AG、AA基因型分別為12例，28例，4例和16例，32例，8例;對照組中合并有高血壓的患者(56例)與不合并高血壓的患者(51例)的 GG、AG、AA基因型分別為11例，22例，23例和6例，32例，13例，各亞組G/A等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡性檢驗。對三種基因型在房顫組與對照組中的分布比較發(fā)現(xiàn):①在207例研究對象中，高血壓患者與非高血壓患者的GG、AG、AA基因型分布和G/A等位基因頻率無明顯差異(P=0.323);②在100例房顫患者中，GG、AG、AA基因型分布和G/A等位基因頻率在合并有高血壓與不合并高血壓的患者中無明顯差異(P=0.690);③房顫組中的高血壓患者與對照組中的高血壓患者的GG、AG、AA基因型分布和G/A等位基因頻率均存在顯著差異(P=0.002，P=0.005);④不合并高血壓的房顫患者與對照患者相比，房顫患者的GG基因型明顯多于對照患者(P=0.032)。

圖2 rs3825214位點單核苷酸多態(tài)性測序結果

表2 房顫組和對照組間rs3825214位點基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.4 臨床特征及rs3825214G/A多態(tài)性與房顫的關系 年齡、性別、吸煙史、體重、身高、BMI、收縮壓、舒張壓、糖尿病、高血壓、射血分數(shù)與房顫發(fā)生無相關性，而冠心病的發(fā)生率與房顫的發(fā)生呈負相關(P=0.046)，左房內徑和右房內徑與房顫的發(fā)生呈正相關(均P＜0.001)，rs3825214G/A多態(tài)性與房顫發(fā)生明顯相關(P=0.001)。見表3。

表3 臨床資料與房顫的相關分析

2.5 Logistic多元回歸分析 冠心病與左、右心房內徑及rs3825214G/A多態(tài)性對房顫的發(fā)生有影響。見表4。

表4 臨床資料對房顫的Logistic多元回歸分析

3 討論

TBX5是T-box轉錄因子基因家族的重要成員，主要通過其特有的T-box結構域與下游靶基因結合，調控著胚胎早期階段的生長發(fā)育，主要控制著心臟和上肢的發(fā)育形成。TBX5基因參與了整個心臟發(fā)育過程的調控，TBX5基因在胚胎心臟發(fā)育中的精確表達對心房的正常發(fā)育起著十分重要的作用。

TBX5基因突變會導致TBX5轉錄因子異常表達，TBX5轉錄因子過表達或表達缺陷都會使心臟發(fā)育畸形，房室腔的結構或功能異?！?〕。Postma等〔9〕報道了 TBX5基因 c.373G ＞A 錯義突變可導致p.Gly125Arg氨基酸的改變，顯著增強了TBX5的下游效應子Nppa、Cx40、Kcnj2和Tbx3的表達，這些效應基因的表達與功能異常可能與心肌傳導性、復極特性等電生理異常相關，即可能增加心房顫動的易患性。Holm等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，TBX5基因rs3825214位點變異與PR間期和QRS時限異常顯著相關，同時發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與房顫發(fā)生也存在關聯(lián)。

TBX5基因rs3825214位點的變異是否影響下游效應子的表達水平，在中國漢族人群中與房顫發(fā)生是否相關是一個值得探討的問題。

本研究結果顯示:TBX5基因rs3825214位點G/A多態(tài)性與房顫的發(fā)生明顯相關，其發(fā)生機制可能為:①位于內含子中的rs3825214位點多態(tài)性可使TBX5轉錄因子過高表達或表達降低，TBX5轉錄因子表達異常將影響多種下游效應子的表達，如Nppa、Cx40、Kcnj2和Tbx3等，這些轉錄因子對心臟發(fā)育及心臟傳導系統(tǒng)的形成起著十分重要的作用，這些轉錄因子的異常表達會大大增加房顫發(fā)生的風險;②基因多態(tài)性的表型受種族、地域及不同研究人群等多因素的影響，在我們所選擇的研究人群中，TBX5基因rs3825214位點多態(tài)性對房顫發(fā)生的影響可能比其他種族或地域的人群更大。

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