應(yīng)瓊瓊 劉 婷 顧 蔚 (陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

紫外線照射對(duì)果蠅凋亡相關(guān)基因reaper、grim、hid表達(dá)的影響

應(yīng)瓊瓊 劉 婷 顧 蔚 (陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

目的 探討紫外線照射對(duì)果蠅凋亡相關(guān)基因reaper(rpr)，grim，hid表達(dá)的影響。方法 收集8 h內(nèi)羽化果蠅，雌雄分開培養(yǎng)至10日齡，紫外線照射0，0.5，1，1.5，2 h。提取果蠅總RNA，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法檢測(cè)各組果蠅rpr、grim、hid基因的表達(dá)。結(jié)果 對(duì)照組果蠅rpr、grim、hid基因表達(dá)較弱，照射后rpr、grim、hid基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。結(jié)論 紫外線照射可增加果蠅凋亡相關(guān)基因rpr，grim，hid的表達(dá)，可能是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制之一，但照射達(dá)到一定時(shí)間，基因表達(dá)減弱，可能是其引起衰老的原因。

紫外線照射;黑腹果蠅;凋亡相關(guān)基因;基因表達(dá)

紫外線照射會(huì)影響果蠅幼蟲的細(xì)胞形態(tài)，并且影響細(xì)胞分裂〔1〕，會(huì)損傷果蠅基因組 DNA，從而引起更多的細(xì)胞凋亡〔2〕，顯著降低果蠅壽命和繁殖力，對(duì)求愛行為也會(huì)產(chǎn)生不利影響〔3〕，連續(xù)照射果蠅三代，結(jié)果顯示子代數(shù)量減少，羽化時(shí)間縮短，體重減輕，具有致畸和間接誘變效應(yīng)〔4〕。機(jī)體通過凋亡的方式清除受損細(xì)胞，短時(shí)間的紫外線照射會(huì)引起果蠅損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)〔5〕，若照射時(shí)間過久這種損傷沒有及時(shí)修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致基因突變，細(xì)胞癌變或死亡，從而誘發(fā)癌癥〔6〕。因此，有關(guān)紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制成為此領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。輻射會(huì)引起果蠅細(xì)胞凋亡的變化，但對(duì)其規(guī)律及相關(guān)基因的表達(dá)目前沒有足夠的分析，因此本實(shí)驗(yàn)通過紫外線照射處理果蠅，從mRNA水平上來探討其對(duì)果蠅凋亡相關(guān)基因rpr，grim，hid表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 野生型黑腹果蠅Canton-S品系，培養(yǎng)于恒溫恒濕培養(yǎng)箱，(25±1) ℃，相對(duì)濕度(RH)60% ～75%，12 L：12 D。

1.2 試劑與儀器 Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit、Taq酶、dNTP均購自TaKaRa公司;氯仿、異丙醇、無水乙醇均為分析純。254.7 nm紫外燈(220 V，15 W);Microfuge 22 R離心機(jī)、DU 730核酸/蛋白分析儀，BECKMAN公司;PTC-200 PCR，BIORAD公司;Tanon-1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制 本實(shí)驗(yàn)果蠅采取玉米-糖-酵母(CSY)基本培養(yǎng)基培養(yǎng)〔7，8〕。

1.3.2 紫外線照射 收集基本培養(yǎng)基中8 h內(nèi)羽化未交配的果蠅，按雌雄隨機(jī)分管培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至10日齡后進(jìn)行紫外線照射。每組雌雄果蠅各20只，放在培養(yǎng)皿中，表面覆蓋一層有孔薄膜，置于紫外光源下15 cm處分別照射 0，0.5，1，1.5，2 h。

1.3.3 果蠅rpr，grim，hid基因表達(dá)的檢測(cè) 采用Trizol常規(guī)一步法提取總RNA，測(cè)定RNA樣品純度，取總RNA 1 μg，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物由上海生工公司合成，以GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列如下，rpr上游引物：5'-TGGCAGTGGCATTCTACATACC-3'，下游引物：5'-ATCCTCATTGCGATGGCTTG-3'，退火溫度：64℃，擴(kuò)增片段長度：296 bp。grim上游引物：5'-GTTCGTCAAAAAGCGACAAGTT-3'，下游引物：5'-TGGCCATGGCGGTATTTAAT-3'，退火溫度：55℃，擴(kuò)增片段長度：253 bp。hid上游引物：5'-GCAGGAAGGAAGGAAGCGGATAAG-3'，下游引物：5'-GAGGTGGTGGTGTTCGGCGATT-3'，退火溫度：66 ℃，擴(kuò)增片段長度：201 bp。GAPDH上游引物：5'-TGGGATACACCGATGAGG-3'，下游引物：5'-TGTGGGTGGGTAGTGTTCTT-3'，退火溫度：54℃，擴(kuò)增片段長度：220 bp。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.0 μl，Mg2+1.2 μl，Taq 酶 0.2 μl，dNTPs 0.8 μl，模板 cDNA 1.0 μl，上下游引物各 0.4 μl，加滅菌蒸餾水補(bǔ)充至20 μl。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。取5 μl PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。所有樣本均取樣3次，進(jìn)行3次RT-PCR分析，要求相同結(jié)果需達(dá)到2次以上。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè) 用核酸∕蛋白分析儀檢測(cè)總RNA，其OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，符合后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)到28 S、18 S、5 S三條帶，且18 S較寬較亮，28 S與5 S亮度接近，弱于18 S，RNA結(jié)構(gòu)基本保持完整，DNA與蛋白質(zhì)的污染極少，表明抽提到較高質(zhì)量的總RNA(圖1)。

2.2 內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá) 紫外線照射前后，均擴(kuò)增出GAPDH基因，片段大小為220 bp，與預(yù)期相同(圖2)，且在各樣本中表達(dá)均一，表明該內(nèi)參基因及RT-PCR體系符合半定量表達(dá)分析的要求。

2.3 果蠅rpr基因的表達(dá) 對(duì)照組果蠅rpr基因表達(dá)非常弱，照射后rpr基因表達(dá)量顯著增加(圖2)，雄蠅照射1.5 h表達(dá)量最高，2.0 h時(shí)表達(dá)量下調(diào)回對(duì)照組水平，雌蠅照射0.5 h表達(dá)量最高，隨時(shí)間延長表達(dá)量略有下調(diào)。

2.4 果蠅grim基因的表達(dá) 對(duì)照組果蠅grim基因表達(dá)非常弱，照射后grim基因表達(dá)量顯著增加(圖2)，雄蠅照射1.0，1.5 h表達(dá)量最高，雌蠅照射0.5，1.0，1.5 h表達(dá)量最高，2.0 h時(shí)均下調(diào)回對(duì)照組水平。

2.5 果蠅hid基因的表達(dá) 對(duì)照組果蠅hid基因表達(dá)較弱，照射后hid基因表達(dá)量顯著增加(圖2)，雄蠅照射0.5 h表達(dá)量最高，1.5 h時(shí)表達(dá)量下調(diào)回對(duì)照組水平，雌蠅照射1.0 h表達(dá)量最高，2.0 h時(shí)表達(dá)量均顯著下調(diào)。

圖1 果蠅總RNA

圖2 紫外線照射后果蠅體內(nèi)GAPDH、rpr、grim、hid基因的表達(dá)

3 討論

本文結(jié)果表明紫外線照射可以誘導(dǎo)rpr，grim，hid的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而修復(fù)造成的損傷。但當(dāng)照射達(dá)到一定時(shí)間，損傷程度超過了生物體修復(fù)能力，凋亡基因的表達(dá)減弱甚至低于正常水平，組織、器官的功能就逐步發(fā)生障礙，導(dǎo)致壽命降低，與本實(shí)驗(yàn)室前期所證實(shí)的γ射線照射雄蠅能顯著縮短其壽命相符〔8〕。Bergmann等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅的發(fā)育進(jìn)程中，rpr和grim僅在將要死亡的細(xì)胞中表達(dá)，而hid可以在正常存活的細(xì)胞中表達(dá)，與本文結(jié)果一致。有關(guān)衰老機(jī)制的學(xué)說認(rèn)為，體內(nèi)某種程度的損傷不斷累積，能影響細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，最終造成衰老，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組雄蠅rpr、grim、hid基因表達(dá)量高于雌蠅，間接表明雄蠅體內(nèi)細(xì)胞凋亡的程度高于雌蠅，這就和雄蠅壽命普遍低于雌蠅相一致。果蠅體內(nèi)hid基因?qū)ψ贤饩€照射的耐受程度可能低于rpr和grim基因。此外，雌雄果蠅的rpr、grim、hid基因表達(dá)量達(dá)到最高時(shí)所對(duì)應(yīng)的紫外線照射時(shí)間各不相同，這可能與雌雄個(gè)體內(nèi)該基因?qū)ψ贤饩€照射的敏感度不同有關(guān)，雌蠅體內(nèi)rpr、grim基因?qū)ψ贤饩€刺激的敏感度高于雄蠅，而hid基因剛好相反。由本實(shí)驗(yàn)可得出，紫外線照射能影響果蠅凋亡相關(guān)基因rpr、grim、hid表達(dá)，照射一定時(shí)間，基因表達(dá)減弱，進(jìn)而導(dǎo)致生物體機(jī)能紊亂，機(jī)體逐漸趨于衰老。高強(qiáng)度的紫外線照射會(huì)對(duì)人皮膚產(chǎn)生紅斑效應(yīng)，導(dǎo)致皮膚癌〔6〕，還可損傷呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及誘發(fā)白內(nèi)障等諸多疾病〔10〕。因此紫外輻射對(duì)于生物體的影響效應(yīng)越來越多的受到關(guān)注和重視。

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Effect of ultraviolet irradiation on the expressions of apoptosis related genes reaper，grim，hid in Drosophila YING Qiong-Qiong，LIU Ting，GU Wei.

College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，Shaanxi，China

Objective To study the effect on the expressions of apoptosis related genes reaper(rpr)，grim，hid in Drosophila melanogaster after ultraviolet irradiation.Methods The flies of Drosophila were collected within 8 hours after eclosion.After cultured on standard medium for 10 days，flies were exposed to ultraviolet for different times(0.0 ，0.5，1.0，1.5，2.0 h).Then the total RNA from flies were extracted.The expressions of genes rpr，grim，hid were detected by Reverse Transcription PCR(RT-PCR).Results In the control group，the expressions of apoptosis related genes rpr，grim，hid in Drosophila were weak.After ultraviolet irradiation，the expressions of genes rpr，grim，hid were increased at first and then decreased.Conclusions Ultraviolet irradiation can enhance the expressions of apoptosis related genes rpr，grim，hid in Drosophila，which may be one of the molecular mechanisms of apoptosis induced by ultraviolet.But after a certain time exposure，expressions are decreased，which may be the cause of aging.

Ultraviolet irradiation;Drosophila melanogaster;Apoptosis related gene;Gene expression

Q786

A

1005-9202(2012)11-2307-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.044

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(GK201002042)

顧 蔚(1963-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事發(fā)育遺傳與衰老研究。

應(yīng)瓊瓊(1988-)，女，在讀碩士，主要從事發(fā)育遺傳學(xué)研究。

〔2011-07-27收稿 2011-12-12修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)