高 飛，陳 宏，張 樺，郭南京，徐艷花，蔡德鴻

糖尿病前期是介于正常血糖和糖尿病之間的糖代謝紊亂狀態(tài)，發(fā)病機制與胰島β細胞受損[1]及胰島素抵抗有關(guān)[2]。多項研究證實[3－4]，糖尿病前期發(fā)生糖尿病、心血管疾病及卒中的風(fēng)險較高，總死亡率也明顯增加，因此對糖尿病前期的干預(yù)至關(guān)重要。促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和膽堿能神經(jīng)受體系統(tǒng)，分別在胰島β細胞增殖與胰島素分泌中起重要作用。作為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的特異性抑制劑，海馬膽堿能神經(jīng)刺激肽前體蛋白(HCNP－pp)可抑制MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減少細胞增殖;HCNP－pp氨基末端經(jīng)類糜蛋白酶裂解為含11個氨基酸殘基的多肽，即海馬膽堿能神經(jīng)刺激肽(HCNP)，HCNP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可促進乙酰膽堿合成，影響膽堿能神經(jīng)受體系統(tǒng)[5]。胰高血糖素樣多肽(glucagon－like peptide－1，GLP－1)為一種腸促胰島激素，不但可結(jié)合自身受體，作用于cAMP－PKA途徑引起胰島素分泌，還可與乙酰膽堿協(xié)同活化膽堿能神經(jīng)受體而引起胰島素分泌[6]。此外，細胞培養(yǎng)及動物實驗均已證實，GLP－1可激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進胰島β細胞增殖[7]。然而，GLP－1引起的上述作用是否與HCNP－pp和HCNP相關(guān)，目前尚無文獻報道。本研究中，對糖尿病前期OLETF大鼠腹腔注射不同劑量的GLP－1類似物利拉魯肽，探究了利拉魯肽影響胰島β細胞增殖和促胰島素釋放的可能機制。

1 材料和方法

1.1 動物分組與處理

OLETF大鼠(日本大冢制藥株式會社德島研究所惠贈)為膽囊收縮素－A受體基因敲除鼠，因進食量大、體重增加迅速、伴有高胰島素血癥及血糖升高等，可自發(fā)2型糖尿病。LETO大鼠是OLETF大鼠同品系自然生長鼠，可作為OLETF大鼠陰性對照組(LETO組)。所有雄性4周齡大鼠均在南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心清潔級飼養(yǎng)室普通飼料飼養(yǎng)，溫度(21±2)℃，光照14 h，濕度(60±15)%。所有動物飼養(yǎng)8～10周后，禁食15 h，行口服葡萄糖耐量試驗(葡萄糖2 g/kg，胃管灌入)，以葡萄糖氧化酶法(雅培血糖儀，美國)分別檢測30，60，90，120 min時鼠尾靜脈血糖，糖尿病診斷標準按國際大鼠糖尿病標準，符合血糖峰值大于16.8 mmol/L或餐后2 h血糖大于11.1 mmol/L即為糖尿病前期。分別于給藥2，4，6，8，10，12 周末再次行口服葡萄糖耐量試驗，測各組大鼠體重，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢中美科技有限公司)檢測空腹血清胰島素。將處于糖尿病前期的OLETF大鼠隨機分為L－100組、L－200組和 PBO組(安慰劑組)，每組 8只。L－100組和L－200組大鼠分別給予100μg/kg和200μg/kg利拉魯肽(丹麥諾和諾德公司，劑型為預(yù)填充注射筆，規(guī)格為3 mL∶18 mg)及0.9%氯化鈉注射液1.0 mL/kg，每日2次，腹腔內(nèi)注射。LETO組和PBO組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液腹腔內(nèi)注射。每兩周行口服葡萄糖耐量試驗，12周后以50%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，提取胰腺組織，行免疫組化染色及蛋白印跡、實時定量PCR等試驗。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)染色:取經(jīng)10%甲醛固定的標本，24 h內(nèi)石蠟包埋，酒精梯度脫水后，行胰島素免疫組化染色，光鏡下觀察胰島細胞形態(tài)，應(yīng)用Image J軟件分析胰島素陽性表達細胞密度值(positivecell denisity，PCD)。

胰腺組織相關(guān)基因熒光定量分析:應(yīng)用Trizol液(Invitrogen公司，美國)裂解胰腺組織，按說明書提取總RNA，－80℃保存。將 HCNP －pp、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)、3型毒蕈堿受體(type 3 muscarinic receptor，M3R)和GLP－1R基因mRNA序列進行分析，設(shè)計特異性引物:HCNP－pp上游引物序列為5'－TGGTGTATGAGCAGGAGCAG－3'，下游引物序列為5'－TCCCAGGTGGTA CTTCTTGC－3'，擴增片段長度116 bp;ChAT上游引物序列為5'－TTCCAA GACACCAAT GACCA－3'，下游引物序列為5'－AGT GGCTGT CCA GCA GAGTT－3'，擴增片段長度85 bp;M3R上游引物預(yù)序列為5'－CAT CATTGGCAA CAT CCT TG－3'，下游引物序列為5'－AGGCCA GGCTTA AGA GGA AG－3'，擴增片段長度89 bp;GLP－1R上游引物序列為5'－CCT GAG GAA CAGCTCCTG TC－3'，下游引物序列為 5'－CTG GTG CAG TGCAAG TGT CT－3'，擴增片段長度119 bp。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。應(yīng)用ABI 7500 Real－time PCR 儀(Applied Biosystems Inc，美國)和 Syber Green RNA擴增試劑盒(Takara生物技術(shù)公司，中國)，采用一步法進行RT－PCR反應(yīng)，反應(yīng)方案依據(jù)試劑盒操作步驟。實時定量PCR體系(20μL):實時熒光定量試劑2×SYBR Premix Ex TaTM 10μL，ROXReference DyeⅡ0.4μL，10μmol/μL 上、下游引物各 0.4μL，cDNA模板 1.0μL，雙蒸水 17.8μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)反應(yīng)5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，于每個循環(huán)延伸反應(yīng)最后時刻收集熒光信號。

胰腺組織HCNP－pp和GLP－1R蛋白表達分析:采用Western印跡方法，以增強化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶，用Universal hoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)(捷達科技發(fā)展有限公司，中國)成像，ImageJ軟件分析條帶灰度值，β－actin作為內(nèi)參照。一抗購于美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的二抗、增強化學(xué)發(fā)光試劑盒和硝酸纖維素膜購于美國Amersham公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理分析，計量資料用X±s表示，對結(jié)果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，組間比較用單因素方差分析檢驗。P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重、口服葡萄糖耐量試驗及空腹胰島素

經(jīng)12周藥物處理，PBO組大鼠體重、血糖、空腹血清胰島素均明顯高于L－100組，L－200組及LETO組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 胰島免疫組化形態(tài)學(xué)分析

光鏡光鏡下觀察，LETO組胰島形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整，胰島內(nèi)PCD分布均勻;PBO組胰島內(nèi)PCD明顯減小，分布不均勻;L－100組胰島內(nèi)PCD較PBO組無明顯改善，L－200組胰島形態(tài)明顯改善，胰島內(nèi)PCD較PBO組明顯增加。見圖1和表1。

圖1 光鏡下胰腺胰島素免疫組化染色(×400)

表1 4組大鼠體重、血糖、胰島素抵抗指數(shù)及胰島素陽性細胞密度(X±s)

2.3 大鼠胰腺組織相關(guān)基因表達情況

與 PBO組比較，LETO組、L－100組、L－200組 HCNP－pp相對表達水平下降，ChAT，M3R，GLP－1RmRNA相對表達水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2和表2。

2.4 大鼠胰腺組織HCNP－pp和GLP－1R蛋白表達情況

與 PBO組比較，L－100組、L－200組、LETO組 CTHCNP－pp和NT－HCNP－pp蛋白相對含量均明顯減低，GLP－1R蛋白相對含量均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3和表3。

圖2 大鼠胰腺 HCNP－pp，ChAT，M3R，GLP－1RmRNA表達

表 2 4組大鼠 HCNP－pp，ChAT，M3R，GLP－1RmRNA相對含量(×105拷貝，X±s)

圖3 大鼠胰腺HCNPpp和GLP－1R蛋白含量表達

表3 4組大鼠HCNP－pp，GLP－1R蛋白水平相對含量(X±s)

3 討論

利拉魯肽作為人GLP－1類似物，因增加了脂肪酸側(cè)鏈，可阻止二肽基肽酶Ⅳ(DPP－Ⅳ)的降解，延長對胰島β細胞的作用。利拉魯肽不但顯著提高β細胞功能，還可增加β細胞體積及數(shù)量[8－9]。本研究結(jié)果顯示，對糖尿病前期OLETF大鼠腹腔注射不同劑量的利拉魯肽，具有改善胰島增殖及分泌功能的作用，從而延緩糖尿病的發(fā)生。HCNP－pp可與Raf－1蛋白激酶結(jié)合，干擾Raf－1對MAPKK的磷酸化和激活，進一步抑制MAPK途徑，阻止細胞增殖[10]。Zhang等[11]通過熒光雙染、免疫組化染色等技術(shù)顯示，HCNP－pp特異存在于胰島細胞，可抑制MAPK信號途徑，抑制胰島β細胞增殖。因HCNP分子量較小，蛋白印跡技術(shù)不能表達其含量，故將其增強發(fā)光，以硝酸纖維素膜洗脫羧基端HCNP－pp蛋白抗體后，重新加用氨基端HCNP－pp蛋白特異抗體，應(yīng)用氨基端與羧基端HCNP－pp蛋白相對含量的比值間接表示其含量。

本研究結(jié)果顯示，IGT－OLETF大鼠GLP－1R，CT－HCNP－pp，NT－HCNP－pp蛋白表達水平增高、氨基及羧基末端HCNP－pp比值增高，GLP－1R，ChAT，M3R基因表達水平明顯下降，HCNP－pp基因表達水平上升，表明糖尿病前期OLETF大鼠腸促胰島激素作用下降、胰島細胞HCNP－pp增多，出現(xiàn)血糖升高、胰島β細胞增殖能力下降，膽堿能神經(jīng)受體系統(tǒng)受損，進而導(dǎo)致血糖升高、胰島素抵抗、胰島細胞PCD顯著下降;經(jīng)過12周利拉魯肽干預(yù)，OLETF大鼠不僅進食量、體重、血糖顯著降低，HCNP－pp蛋白、基因表達水平以及NT－HCNP－pp/CT－HCNP－pp比值均相應(yīng)下降，GLP－1R蛋白表達水平及GLP－1R基因表達水平升高，ChAT和M3R基因表達水平升高。因此推測，利拉魯肽不但可減少HCNP－pp產(chǎn)生、活化MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、促進β細胞增殖，而且可促進HCNP－pp裂解，使HCNP增多，進一步作用于膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，促進胰島素釋放。

本研究還顯示，不同劑量利拉魯肽干預(yù)的OLETF大鼠在胰島形態(tài)學(xué)方面有所差異，L－100組大鼠胰島細胞形態(tài)及胰島素陽性細胞數(shù)同安慰劑組比較均無明顯改善，結(jié)合L－100組大鼠M3R基因表達水平無明顯升高，推測利拉魯肽(100μg/kg)對處于糖尿病前期的OLETF大鼠胰島β細胞增殖無改善，可能僅通過對GLP－1受體的作用提高胰島素分泌，改善糖尿病前期狀態(tài)。

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