承燕，呂磊，江時(shí)森

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇南京 210002)

黃芪甲苷(AST-Ⅳ)是傳統(tǒng)中藥黃芪的主要成分。有關(guān)AST-Ⅳ減輕心肌缺氧作用機(jī)制的研究［1-4］均強(qiáng)調(diào)其抗氧化能力的重要性。但AST-Ⅳ的抗氧化性在其治療效果中究竟起多大作用還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)以耗氧劑連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)配制的無(wú)糖DMEM溶液處理H9c2細(xì)胞作為缺氧模型，以水溶性維生素E(Trolox)作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)和細(xì)胞存活、凋亡、死亡等情況，探索AST-Ⅳ的抗氧化性對(duì)缺氧細(xì)胞保護(hù)的能力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑

H9c2細(xì)胞(ATCC細(xì)胞庫(kù))，高糖 DMEM、無(wú)糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(博士德)，Na2S2O4(＞99%，無(wú)錫市亞盛化工有限公司)，AST-Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品(＞98%，中國(guó)藥品生物制品鑒定所)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)，丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物研究所)，細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑-8(CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所)，Trolox、DCFH-DA(Sigma-Aldrich公司);annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(Invitrogen)。

1.2 儀器

凈化工作臺(tái)(AIRTECH VS-1300)，CO2培養(yǎng)箱(NAPCO 5410)，低溫離心機(jī)(eppendorf centrifuge 5417R)，熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71-F22FL/PH)，酶標(biāo)儀(Bio-RAD，Model 680)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日立U-3010)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U·ml－1青霉素、0.1 mg·ml－1鏈霉素的高糖 DMEM培養(yǎng)液按1×104cm－2接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)傳代。

1.3.2 細(xì)胞缺糖缺氧模型及藥物處理 當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，換上Na2S2O4無(wú)糖 DMEM 溶液(10 mmol·L－1，pH7.2，現(xiàn)配)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h后PBS洗滌2遍，換上完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20 h。Na2S2O4溶液孵育3 h后取細(xì)胞上清液作血?dú)夥治?，氧分壓始終低于15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。AST-Ⅳ(60 μmol·L－1)和Trolox(50 μmol·L－1)預(yù)處理在 Na2S2O4損傷前 1 h 進(jìn)行，同時(shí)藥物處理貫穿整個(gè)缺氧、復(fù)氧過(guò)程。細(xì)胞按處理方法不同分為4組:(1)對(duì)照組，未作處理;(2)模型組，予缺氧處理;(3)AST-Ⅳ預(yù)處理組，缺氧處理前1 h 予以不同濃度(6.7、20、60、400 μmol·L－1)AST-Ⅳ預(yù)處理;(4)Trolox預(yù)處理組，缺氧處理前1 h予以50 μmol·L－1Trolox 預(yù)處理。

1.3.3 細(xì)胞勻漿的制備 收集細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，反復(fù)凍融3次后，4℃、12 000×g、離心10 min，收集上清，BCA法測(cè)蛋白濃度。

1.3.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 損傷處理后復(fù)氧2 h，用CCK-8測(cè)細(xì)胞活性。該試劑中的WST-8可被細(xì)胞中的脫氫酶還原為高度水溶性的黃色甲臜染料，其生成數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量成正比。每次實(shí)驗(yàn)每組3個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 LDH檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)細(xì)胞上清和細(xì)胞內(nèi)的 LDH，LDH漏出率 =上清 LDH/總 LDH×100%。每次實(shí)驗(yàn)每組3個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 MDA檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明，用硫代巴比妥酸法測(cè)細(xì)胞勻漿中的MDA。每次實(shí)驗(yàn)每組3個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)氧自由基(ROS)檢測(cè) 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%左右進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè):損傷處理后收集細(xì)胞，用終濃度為 20 μmol·L－1的 DCFH2-DA 溶液(高糖 DMEM 稀釋)重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml－1。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育15 min，每5 min顛倒混勻一下。PBS洗滌3次后檢測(cè)熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

熒光顯微鏡觀察:損傷處理后用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入終濃度為 5 μmol·L－1的 DCFH2-DA 溶液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育15 min。用PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.8 凋亡檢測(cè) 收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106ml－1，冷PBS洗滌后用結(jié)合緩沖液重懸，加FITC-annexinⅤ和PI室溫避光染色15 min，流式檢測(cè)凋亡情況。左下象限(annexinⅤ－，PI－)代表活細(xì)胞，右下象限(annexinⅤ+，PI－)代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限(annexinⅤ+，PI+)代表死亡細(xì)胞。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異用單因素方差分析和S-N-K法進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AST-Ⅳ對(duì)細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，經(jīng)無(wú)糖Na2S2O4溶液損傷處理后，細(xì)胞存活率顯著下降(P ＜ 0.01)。20 μmol·L－1和60 μmol·L－1的 AST-Ⅳ能明顯改善細(xì)胞存活率(P ＜0.01)，但 400 μmol·L－1卻不能。

圖1 不同濃度AST-Ⅳ對(duì)Na2S2O4損傷H9c2細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effects of different concentrations of AST-Ⅳon survival of H9c2 cells subjected to Na2S2O4

2.2 細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激情況

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的含量顯著增加。當(dāng)損傷前以 60 μmol·L－1的 AST-Ⅳ或50 μmol·L－1的 Trolox 預(yù)處理時(shí)，這兩項(xiàng)氧化應(yīng)激指標(biāo)能降至接近對(duì)照組，兩種藥物效果相近(圖2)。熒光顯微鏡下各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量的差異與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果類似。Trolox預(yù)處理組的細(xì)胞形態(tài)更接近對(duì)照組，而AST-Ⅳ預(yù)處理組則更偏向于模型組(圖3)。

圖2 AST-Ⅳ或Trolox對(duì)Na2S2O4損傷H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的影響Fig 2 Effects of AST-Ⅳor Trolox on intracellular ROS and MDA production in H9c2 cells subjected to Na2S2O4

圖3 AST-Ⅳ或Trolox對(duì)Na2S2O4損傷H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 熒光顯微鏡 ×400Fig 3 Effect of AST-Ⅳor Trolox on intracellular ROS in H9c2 cells subjected to Na2S2O4 microscopy images ×400

2.3 細(xì)胞存活率和LDH釋放率

CCK-8的檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示，模型組的細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著下降，而經(jīng)藥物預(yù)處理組存活率則較模型組有明顯改善。但AST-Ⅳ預(yù)處理組的存活率低于Trolox預(yù)處理組。

圖4 AST-Ⅳ或Trolox對(duì)Na2S2O4損傷H9c2細(xì)胞存活率的影響Fig 4 Effect of AST-Ⅳor Trolox on survival of H9c2 cells subjected to Na2S2O4

LDH主要由壞死細(xì)胞釋放入細(xì)胞培養(yǎng)液。圖5顯示，模型組LDH釋放率明顯高于對(duì)照組。而藥物預(yù)處理組LDH釋放率較模型組均有下降，且Trolox預(yù)處理組明顯比AST-Ⅳ預(yù)處理組下降得多。

圖5 AST-Ⅳ或Trolox對(duì)Na2S2O4損傷H9c2細(xì)胞LDH釋放率的影響Fig 5 Effect of AST-Ⅳor Trolox on the release of cellular LDH into culture medium of H9c2 cells subjected to Na2S2O4

2.4 細(xì)胞凋亡

如圖6所示，F(xiàn)ITC-annexin V和PI雙染的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組的細(xì)胞凋亡率(27.42%)較對(duì)照組(1.5%)顯著升高。藥物預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率較模型組均有下降，且Trolox預(yù)處理組(7.36%)比AST-Ⅳ預(yù)處理組(17.86%)下降更明顯。

圖6 AST-Ⅳ或Trolox對(duì)Na2S2O4損傷H9c2細(xì)胞凋亡的影響Fig 6 Effect of AST-Ⅳor Trolox on apoptosis of H9c2 cells subjected to Na2S2O4

3 討 論

AST-Ⅳ是傳統(tǒng)中藥黃芪的一種重要活性成分。隨著提取工藝的完善和成熟，20世紀(jì)90年代末人們開(kāi)始了對(duì)AST-Ⅳ這種單體成分的生物學(xué)研究。研究所涉范圍甚廣，體現(xiàn)了AST-Ⅳ在循環(huán)、免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)多方面的保護(hù)作用。

2002 年 Li等［5］在 Acta Pharmacol Sin 上發(fā)表的AST-Ⅳ對(duì)心肌缺血小鼠心臟功能和心肌鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響一文揭開(kāi)了研究AST-Ⅳ對(duì)心肌缺血保護(hù)作用的序幕，提出AST-Ⅳ減輕心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載是其改善缺血心肌功能的主要機(jī)制。Xu等［6］隨后發(fā)現(xiàn)，缺氧再?gòu)?fù)氧后心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶的表達(dá)和活性均下降，而AST-Ⅳ能改善這種情況，支持了AST-Ⅳ能減輕鈣超載的觀點(diǎn)。

與此同時(shí)，AST-Ⅳ抗自由基的能力備受關(guān)注。一方面，AST-Ⅳ在體外直接清除自由基的能力值得肯定，甚至有人提出，以此特性為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定和評(píng)價(jià)黃芪［7］。另一方面，AST-Ⅳ無(wú)論在缺血再灌注的心肌還是在體外缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞中均能提高SOD的活力，降低 MDA 的生成。胡炯宇等［1，4］認(rèn)為，黃芪甲苷在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化作用可通過(guò)上調(diào)SOD的表達(dá)和活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。

ROS和Ca2+都是信號(hào)傳導(dǎo)中的重要信使，它們不僅相互作用，彼此影響，而且能調(diào)節(jié)很多信號(hào)通路，控制細(xì)胞存亡。AST-Ⅳ減輕細(xì)胞缺氧損傷的作用主要是通過(guò)哪條途徑實(shí)現(xiàn)還不能確定［8］。鑒于ROS在細(xì)胞病理生理中的重要作用，我們想要探索AST-Ⅳ清除ROS的能力在保護(hù)缺氧細(xì)胞中能否體現(xiàn)出顯著效果。

我們用無(wú)糖Na2S2O4造成缺氧環(huán)境。在復(fù)氧前，血?dú)夥治鲲@示缺氧液的氧分壓始終低于15 mmHg。此外，在OH－存在條件下，Na2S2O4溶液可生成超氧陰離子(O·－2)，對(duì)細(xì)胞造成一定損傷，但O·－2不能通過(guò)細(xì)胞膜自由擴(kuò)散。H9c2細(xì)胞在10 mmol·L－1的無(wú)糖Na2S2O4溶液中孵育3 h后，存活率顯著下降，LDH漏出增加，損傷明顯。

我們采用DCFH2-DA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度，并檢測(cè)MDA評(píng)價(jià)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度，發(fā)現(xiàn)60 μmol·L－1的 AST-Ⅳ和 50 μmol·L－1的 Trolox 在此損傷模型中表現(xiàn)出相同的抗氧化能力。DCFH2-DA能自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞膜和線粒體膜，在細(xì)胞內(nèi)脂肪酶作用下水解成不能自由透過(guò)細(xì)胞膜的DCFH2，在ROS作用下生成強(qiáng)熒光的DCF，故可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度。MDA為自由基作用于脂質(zhì)的終產(chǎn)物，反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度。

我們又通過(guò) CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率、FITC-annexinⅤ/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、LDH釋放率觀察細(xì)胞壞死情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗氧化能力相同的AST-Ⅳ和Trolox對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用存在明顯差異，AST-Ⅳ不如 Trolox 有效。60 μmol·L－1的 AST-Ⅳ預(yù)處理后，損傷細(xì)胞中的ROS和MDA濃度確實(shí)有很明顯的下降，體現(xiàn)了AST-Ⅳ抗氧化的作用。AST-Ⅳ對(duì)細(xì)胞存活的保護(hù)效果與Trolox存在顯著性差異，提示:(1)細(xì)胞總體的氧化應(yīng)激狀態(tài)并不能準(zhǔn)確提示細(xì)胞狀態(tài);(2)AST-Ⅳ和Trolox的抗氧化機(jī)制可能不同，其差異可能由以下兩方面原因造成，一是在直接清除自由基時(shí)，AST-Ⅳ和Trolox所清除的自由基類型和部位不盡相同，二是除直接清除自由基外，AST-Ⅳ參與了其他調(diào)控自由基的途徑，如SOD和Ca2+等，而且這些間接途徑可能起著更重要的作用。

另外，實(shí)驗(yàn)中特高濃度的 AST-Ⅳ(400 μmol·L－1)并沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)缺氧H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用，提示要關(guān)注AST-Ⅳ的治療窗。大劑量與小劑量的AST-Ⅳ可能在作用機(jī)制上也存在差別。

總而言之，雖然AST-Ⅳ能夠降低無(wú)糖Na2S2O4損傷的H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激，但其抗氧化性在改善細(xì)胞存活率以及凋亡、壞死情況上效果有限。AST-Ⅳ在細(xì)胞內(nèi)作用于哪些自由基，對(duì)自由基產(chǎn)生的影響等均需要明確。另外，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示AST-Ⅳ抗氧化之外的作用，它很可能在AST-Ⅳ抗缺氧復(fù)氧中起了更重要的作用。一些研究證實(shí)其干預(yù)了抗氧化之外的信號(hào)通路，如對(duì) Ca2+、NF-κB 等的調(diào)節(jié)［2，9］。這些非抗氧化途徑是否起了主要作用需要進(jìn)一步明確。

致謝 本實(shí)驗(yàn)中流式細(xì)胞儀上機(jī)操作由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室研究生周鑫同學(xué)完成，特此感謝。

［1］HU J Y，HAN J，CHU Z G，et al.Astragaloside Ⅳ attenuates hypoxia-induced cardiomyocyte damage in rats by upregulating superoxide dismutase-1 levels［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36(4):351-357.

［2］關(guān)鳳英，李紅，楊世杰.黃芪甲苷誘導(dǎo)NO生成并激活PKCε對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，36(2):340-344.

［3］ZHANG W D，CHEN H，ZHANG C，et al.Astragaloside Ⅳfrom Astragalus membranaceus shows cardioprotection during myocardial ischemia in vivo and in vitro［J］.Planta Med，2006，72(1):4-8.

［4］胡炯宇，黃躍生，張瓊，等.黃芪甲苷減輕缺氧心肌細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制研究［J］.中國(guó)燒傷雜志，2007，23(3):175-178.

［5］LI Z P，CAO Q.Effects of astragaloside Ⅳ on myocardial calcium transport and cardiac function in ischemic rats［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23(10):898-904.

［6］XU X L，CHEN X J，JI H，et al.Astragaloside Ⅳ improved intracellular calcium handling in hypoxia-reoxygenated cardiomyocytes via the sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase［J］.Pharmacology，2008，81(4):325-332.

［7］夏之寧，龐媛，鄭國(guó)燦.基于毛細(xì)管電泳的黃芪抗氧化生物指紋圖譜研究［J］.分析化學(xué)，2008，36(12):1646-1650.

［8］承燕，江時(shí)森.黃芪甲苷對(duì)心血管保護(hù)功能的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011，24(6):637-640.

［9］楊國(guó)富，劉革新，董果雄，等.黃芪甲苷對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附能力及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κb表達(dá)的影響［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(15):2843-2846.