邢 飛 姜玉新 劉文艷 李朝品 王 瑩 (皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，蕪湖 241002)

哮喘為臨床常見病、多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，受遺傳和環(huán)境的影響，確定哮喘易感性的相關(guān)基因成為國(guó)內(nèi)外病因?qū)W研究熱點(diǎn)之一［1，2］。目前已發(fā)現(xiàn)幾百個(gè)哮喘易感性基因，其中IL－10基因啟動(dòng)子是目前東亞人群研究較多的哮喘相關(guān)易感基因，但其單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)在不同種族人群中與支氣管哮喘及其相關(guān)表型的聯(lián)系不盡相同。而IL－10基因啟動(dòng)子SNPs與安徽皖南地區(qū)漢族人群支氣管哮喘的相關(guān)性尚未有相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究采用病例－對(duì)照方法，以安徽皖南地區(qū)漢族人群正常個(gè)體和支氣管哮喘患者為研究對(duì)象，采用聚合酶鏈反應(yīng)及直接基因測(cè)序法比較病例組與對(duì)照組間基因型、等位基因頻率的差異，探討 IL－10基因啟動(dòng)子 －1082G/A、－819C/T、－592C/A位點(diǎn)多態(tài)性與安徽皖南地區(qū)漢族人群支氣管哮喘的相關(guān)性，以期為哮喘病的診斷提供早期篩查方法。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 門診及住院的哮喘患者183例，均來(lái)自于皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科和蕪湖第二人民醫(yī)院門診，為安徽皖南地區(qū)長(zhǎng)期居住人口(≥10年)，年齡18～72歲，平均為(34．33±12．942)歲。均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)哮喘學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)(2008年修訂)。對(duì)照組151例均來(lái)自于皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院體檢中心及自愿者(皖南地區(qū)常住人口)，年齡19～62歲，平均為(27．85±2．267)歲;均無(wú)過(guò)敏性疾病的癥狀或病史并排除肝、腎等疾病，見表1。所有研究對(duì)象為皖南地區(qū)漢族，均簽有知情同意書。

1．2 研究方法

1．2．1 樣本采集及DNA提取 采集受檢者外周靜脈血2 ml，用人類基因組DNA提取試劑盒［生工生物工程(上海)有限公司］提取基因組DNA。

1．2．2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)及Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)公布的人類DNA核酸序列設(shè)計(jì)特異性引物(表2)。由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1．2．3 PCR 擴(kuò)增 反應(yīng)體系50μl:模板3μl，引物F 1 μl，R 引物 1 μl，dNTP 1 μl，10 × PCR Buffer 5 μl，Taq 酶 5 U/μl 0．5 μl，雙蒸水 34．5 μl、MgCl24 μl;PCR反應(yīng)條件:變性95℃ 15分鐘，變性95℃ 20秒，退火 56℃30秒，延伸 72℃30秒，35個(gè)循環(huán)，72℃ 5分鐘。取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳25分鐘，在Syngene G:BOX熒光凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行分析。純化PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

表1 哮喘組和對(duì)照組人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征Tab．1 Demographic characteristics of asthmatic and control group

表2 三個(gè)啟動(dòng)子引物序列Tab．2 Three prom oter primer sequence

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各位點(diǎn)進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)以分析樣本的可靠性;基因計(jì)數(shù)法直接計(jì)算各組病例和對(duì)照組的基因型和等位基因型，采用SPSS16．0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn);不同基因位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)哮喘的相對(duì)危險(xiǎn)度采用單變量Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2．1 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn) 經(jīng)對(duì)病例組和對(duì)照組進(jìn)行 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果表明:－1082G/A 哮喘組(χ2=1．632，P=0．28)，對(duì)照組(χ2=1．315，P=0．61);－ 819C/T 哮喘組(χ2=1．471，P=0．15)，對(duì)照組(χ2=1．331，P=0．68)。－592C/A 基因哮喘組(χ2=2．291，P=0．45)，對(duì)照組(χ2=2．752，P=0．71)。說(shuō)明本研究所用樣本均符合Hardy－Weinberg平衡，可進(jìn)行后續(xù)分析。

2．2 基因型頻率和等位基因頻率比較 對(duì)－1082G/A(rs1800896)、－819C/T(rs1800971)、－592C/A(rs1800972)位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組中基因型頻率和等位基因頻率分析，結(jié)果(表3、4)顯示:在安徽皖南地區(qū)漢族人群哮喘組IL－10基因啟動(dòng)子－1082G/A位點(diǎn)，基因型分布與對(duì)照組相比有顯著差異(χ2=16．659，P ＜0．05)，等位基因 G 明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9．122，P ＜ 0．05);而－819C/T位點(diǎn)的基因型分布與對(duì)照組無(wú)顯著差別(χ2=5．326，P ＞0．05)，且等位基因 C 與正常對(duì)照組相比差異亦不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3．147，P＞0．05);－592C/A位點(diǎn)，基因型分布與對(duì)照組存在顯著差異(χ2=10．948，P ＜0．05)，且等位基因 A 和G分布與正常對(duì)照組相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6．730，P ＜0．05)。

表3 哮喘組和對(duì)照組IL-10啟動(dòng)子各位點(diǎn)基因型頻率分布Tab．3 The frequency distribution of IL-10 promoter each loci genotypes in allergic asthma and controls

2．3 PCR擴(kuò)增體系 IL－10基因啟動(dòng)子－1082G/A(rs1800896)、－819C/T(rs1800971)、－ 592C/A(rs1800972)位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)哮喘的相對(duì)危險(xiǎn)度。單變量Logistic回歸分析三個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)系，結(jié)果(表5)表明:－1082G/A位點(diǎn)相對(duì)GG基因型而言，AG、AA與AG+AA基因型，均能顯著增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，OR值(95%CI)分別為 2．709(1．660 ～ 4．420)、2．214(1．099 ～4．462)、2．597(1．660 ～4．420);而 －819C/T 位點(diǎn)相對(duì)CC基因而言，TC、TT、TC+TT基因型均不能增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，OR值(95%CI)為1．093(0．545 ～ 2．191)、0．635(0．308 ～ 1．309)、0．876(0．449～1．708);－592C/A(rs1800972)位點(diǎn)相對(duì)CC基因型而言，AC、CC與AC+CC基因型，均能顯著增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，OR值(95%CI)分別為 2．329(1．363 ～ 3．981)、2．432(1．247 ～4．724)、2．355(1．407 ～3．942)。

表4 哮喘組和對(duì)照組IL-10啟動(dòng)子各位點(diǎn)等位基因頻率分布Tab．4 The frequency distribution of IL-10 promoter each loci alleles in allergic asthma and controls

表5 IL-10啟動(dòng)子各位點(diǎn)的不同基因型對(duì)哮喘的相對(duì)危險(xiǎn)度Tab．5 The IL-10 promoter each loci genotypes odds ratio of the genotypes to asthm a severity

3 討論

人IL－10主要參與抑制和終止炎癥反應(yīng)，如抑制促炎性細(xì)胞因子的合成與釋放，包括 TNF－1β、GM－CSF、IL－5 等［3］。 IL－10 基 因 啟 動(dòng) 子 中 的－1082G/A、－819C/T和 －592C/A位點(diǎn)定位于1q31－32染色體，IL－10的表達(dá)水平很大程度上受遺傳控制［4］。低水平的IL－10可能與哮喘尤其是重度哮喘的發(fā)病機(jī)理有關(guān)［5］，而 －1082A/G、－819T/C和－592A/C的多態(tài)性可影響IL－10自身的產(chǎn)生［6］。Kim［7］研究阿司匹林過(guò)敏性哮喘的病例－對(duì)照中發(fā)現(xiàn)－1082A/G與阿司匹林過(guò)敏性哮喘顯著關(guān)聯(lián)。Bossé等［8］亦發(fā)現(xiàn) IL－10 基因啟動(dòng)子 － 1082G/A、－819C/T和－592C/A的多態(tài)性與哮喘發(fā)生有關(guān)。但Kim等［9］發(fā)現(xiàn)這三個(gè)啟動(dòng)子位點(diǎn)基因型和單體型頻率在兒童哮喘中無(wú)顯著的相關(guān)性。李志方等［10］也發(fā)現(xiàn)IL－10基因啟動(dòng)子這3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與小兒哮喘易感性無(wú)關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)－1082G/A和－592C/A的多態(tài)性與安徽皖南地區(qū)漢族哮喘有顯著相關(guān)性，而－819C/T位點(diǎn)無(wú)相關(guān)性。

已有研究表明，－1082G/A的AA基因型在氣道高反應(yīng)性(AHR)中比AG或 GG基因型多，且－1082A比－1082G更能顯著地減少啟動(dòng)子的活性［7］。但 Zedan 等［11］發(fā)現(xiàn)埃及兒童哮喘患者－1082G/G基因頻率顯著增高，而－1082G/A基因頻率卻顯著降低。而在日本兒童中發(fā)現(xiàn)－1082G/A基因多態(tài)性與日本兒童食物過(guò)敏有相關(guān)性［12］。最近研究發(fā)現(xiàn)雖然－819C/T和－592C/T的多態(tài)性與哮喘發(fā)病有關(guān)聯(lián)，但基因－基因分析與哮喘和過(guò)敏體質(zhì)無(wú)相關(guān)性［13］。本研究發(fā)現(xiàn)－1082/A(rs1800896)位點(diǎn) AG、AA、AG+AA基因型和 －592C/A(rs1800872)位點(diǎn)AC、CC、AC+CC基因型均與安徽皖南地區(qū)漢族哮喘有相關(guān)性。而 －819C/T(rs1800871)位點(diǎn)TC、TT、TC+TT基因型均與哮喘無(wú)相關(guān)性?？傊?，不同地區(qū)人群其單核苷酸多態(tài)性與同一疾病的相關(guān)性不同，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 Vercelli D．Geneticsand biology of asthma2010:La'cidarem lamano．．．［J］．JAllergy Clin Immunol，2010;125(2):347－348．

2 Klassert T E，Sánchez J J，Almeida T A et al．Common variants of the neuropeptide expressing tachykinin genes and susceptibility to asthma:a case－control study ［J］．JNeuroimmunol，2010;227(1－2):202－207．

3 Barnes P J．The cytokine network in asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］．JClin Invest，2008;118(11):3546－3556．

4 Eskdale J，Gallagher G，Verweij C L etal．Interleukin 10 secretion in relation to human IL－10 locus haplotypes ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(16):9465－9470

5 Fiorentino D F，Zlotnik A，Mosmann T R et al．IL－10 inhibits cytokine production by activatedmacrophages［J］．JImmunol1991;147(11):3815－3822

6 Nemec P，Goldbergova M P，Gatterova J et al．Association of polymjorphisms in interleukin－10 gene promoter with autoantibody production in patients with rheumatoid arthritis［J］．Am NY Acad Sci，2009;1173:501－508．

7 Kim SH，Yang EM，Lee H N etal．Combined effectof IL－10 and TGF－beta1 promoter polymorphismsasa risk factor for aspirin－intolerantasthma and rhinosinusitis［J］．Allergy，2009;64(8):1221－1225．

8 BosséY，LemireM，Poon A H etal．Asthma and genesencoding components of the vitamin D pathway［J］．Respir Res，2009;10:98．

9 Kim KW，Lee K E，Hong JY et al．Involvement of IL－10 gene promoter polymorphisms in the susceptibility for childhood asthma ［J］．Lung，2011;189(5):417－423．

10 李志方，盧健紅，李景柔．IL－10基因啟動(dòng)子多態(tài)性與小兒哮喘的相關(guān)性［J］．中原醫(yī)刊，2007;34(14):4－5．

11 Zedan M，Settin A，F(xiàn)arag M K et al．Gene polymorphisms of tumor necrosis factor alpha－308 and interleukin－10－1082 among asthmatic Egyptian children［J］．Allergy Asthma Proc，2008;29(3):268－273．

12 Campos Alberto EJ，Shimojo N，Suzuki Y et al．IL－10 gene polymorphism，but not TGF－beta1 gene polymorphisms，is associated with food allergy in a Japanese population［J］．Pediatr Allergy Immunol，2008;19(8):716－721．

13 Bottema RW，KerkhofM，Reijmerink N E etal．Gene－gene interaction in regulatory T－cell function in atopy and asthma development in childhood［J］．JAllergy Clin Immunol，2010;126(2):338－346，346．