翁玉英 林東紅 吳荔香 林德馨 成 玲 薛曉光 陳光榮 廖 翏

(福建省婦幼保健院檢驗(yàn)科，福州 350001)

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病原因目前尚不清楚，國(guó)內(nèi)外大量資料證實(shí)，早婚、早育、多產(chǎn)、性生活紊亂以及有人乳頭狀瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染的婦女有較高患病率。近年來(lái)有研究表明，宮頸癌的發(fā)生還與細(xì)胞周期蛋白(cyclins)的表達(dá)和調(diào)控異常密切相關(guān)。許多資料顯示，在已發(fā)現(xiàn)的cyclins(A～I(xiàn))九個(gè)成員中，cyclin B、D、E的表達(dá)與宮頸癌密切相關(guān)。cyclin G1是一類發(fā)現(xiàn)較晚的細(xì)胞周期蛋白G的一個(gè)亞型，其確切功能尚未完全認(rèn)識(shí)清楚，它與宮頸癌關(guān)系的研究也鮮為報(bào)道。本課題組之前研究報(bào)道了CIN和宮頸癌中cyclin G1蛋白的表達(dá)與HPV分子亞型感染情況，結(jié)果顯示cyclin G1蛋白在宮頸癌中高表達(dá)，并與高危型HPV有顯著正相關(guān)［1］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究cyclin G1 mRNA和cyclin G1蛋白在CIN和宮頸癌中的表達(dá)及其相關(guān)性，并分析其與臨床病理因素的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 收集2007年11月到2008年9月經(jīng)我院病理確診的福爾馬林固定、石蠟包埋標(biāo)本107例，術(shù)前均未放、化療，具有完整的臨床資料和病理資料。其中宮頸癌組46例，患者年齡33～64歲，中位年齡46歲。組織學(xué)分級(jí)(按WHO標(biāo)準(zhǔn)):Ⅰ/Ⅱ級(jí)31例，Ⅲ級(jí)15例;臨床分期［按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，1994)修訂的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分期］:Ⅰ期20例，≥Ⅱ期26例;局部腫瘤大小:＜4 cm者27例，≥4 cm者19例;間質(zhì)浸潤(rùn)程度:浸潤(rùn)≤1/2肌層17例，浸潤(rùn) ＞1/2肌層29例;脈管和(或)宮旁浸潤(rùn):有浸潤(rùn)25例，無(wú)浸潤(rùn)21例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有轉(zhuǎn)移13例，無(wú)轉(zhuǎn)移33例。CIN組43例，患者年齡31～58歲，中位年齡43歲，包括CINⅠ組21例，CINⅡ/Ⅲ組22例。對(duì)照組18例，為因良性病變行子宮全切的正常宮頸組織，患者年齡34～57歲，中位年齡44歲。三組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。全部標(biāo)本均3～4μm厚連續(xù)切片，用于HE染色、免疫組化和原位雜交檢測(cè)，并得到高年資病理醫(yī)師再次確診證實(shí)。

1．2 試劑 cyclin G1(SC-8016)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司;PV-9000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒等均購(gòu)自北京中杉生物公司;cyclin G1 mRNA(MK1287-h)原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1．3 方法

1．3．1 原位雜交法檢測(cè)cyclin G1 mRNA的表達(dá)3%胃蛋白酶消化5分鐘，雜交液42℃雜交過(guò)夜，DAB顯色，其余原位雜交步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書。以PBS代替雜交液作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性結(jié)腸癌切片作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判讀:cyclin G1 mRNA陽(yáng)性染色為細(xì)胞漿呈棕褐色或棕黃色顆粒，胞核可有少量表達(dá)。400倍顯微鏡下每張載玻片計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行半定量分析:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性，即“－”;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽(yáng)性，其中5% ～25%為“+”，26% ～50%為“++”，＞50%為“+++”。

1．3．2 免疫組化二步法檢測(cè)cyclin G1蛋白的表達(dá)一抗(1∶50稀釋)4℃濕盒過(guò)夜，抗原高溫高壓進(jìn)行修復(fù)，DAB顯色，其余免疫組化步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性結(jié)腸癌切片作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判讀:cyclin G1陽(yáng)性染色為細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、陽(yáng)性顆粒定位好、著色與背景對(duì)比清楚。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比半定量分析與原位雜交法同。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法，表達(dá)強(qiáng)度的比較和相關(guān)性分析采用Spearman雙變量相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 不同級(jí)別宮頸病變組織cyclin G1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況 cyclin G1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，cyclin G1蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，兩者陽(yáng)性表達(dá)部位均與病變部位基本相符(圖分別見(jiàn)圖1和參考文獻(xiàn)1)。在正常對(duì)照組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組和宮頸癌組中，cyclin G1 mRNA和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與宮頸病變級(jí)別均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)和 P值分別為 r=0．378，P=0．000;r=0．487，P=0．000。

圖1 原位雜交法檢測(cè)正常宮頸上皮、CIN和宮頸癌組織的cyclin G1 mRNA表達(dá)情況(×400)Fig．1 Expression of cyclin G1 m RNA in norm al cervix tissue，CIN and cervical carcinom a(ISH，DAB staining，×400)

表1 正常對(duì)照組、CIN組和宮頸癌組cyclin G1 mRNA和蛋白的表達(dá)(n=107)Tab．1 The expressions of cyclin G1 m RNA and cyclin G1 protein in normal cervix tissue，CIN and cervical carcinoma(n=107)

表2 正常對(duì)照組、CIN組和宮頸癌組cyclin G1 mRNA與cyclin G1蛋白表達(dá)的相關(guān)性(n=107)Tab．2 Relation of cyclin G1 protein expression with cyclin G1 m RNA expression in normal cervix tissue，CIN and cervical carcinoma(n=107)

表3 宮頸癌cyclin G1 mRNA、cyclin G1蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系(%，n=46)Tab．3 Relations of cyclin G1m RNA expression and cyclin G1 protein expression with clinical pathologic characters in cervical carcinoma(%，n=46)

如表1結(jié)果所示，CIN組與宮頸癌組的cyclin G1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為46．5%和60．9%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，但均顯著高于正常對(duì)照組(11．1%，P ＜0．05);CINⅡ/Ⅲ組的 cyclin G1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率(45．5%)與 CINⅠ組(47．6%)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。

正常對(duì)照組、CIN組和宮頸癌組的cyclin G1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為5．6%、51．2%和71．7%，呈遞增趨勢(shì)，且差異均有顯著性意義(P＜0．05);CINⅡ/Ⅲ組的cyclin G1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(59．1%)與CINⅠ組(42．9%)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

2．2 cyclin G1 mRNA與cyclin G1蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在所檢測(cè)的107標(biāo)本中，cyclin G1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)而cyclin G1蛋白陰性表達(dá)10例，cyclin G1mRNA陰性表達(dá)而cyclin G1蛋白陽(yáng)性表達(dá)16例，兩者都陽(yáng)性表達(dá)40例，兩者都陰性表達(dá)41例。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0．530，P=0．000。參見(jiàn)表2。進(jìn)一步分析顯示，在正常對(duì)照組、CIN組和宮頸癌組中，cyclin G1蛋白與cyclin G1 mRNA的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)和P值分別為r=0．686，P=0．002;r=0．445，P=0．003 和 r=0．387，P=0．008。

2．3 宮頸癌cyclin G1mRNA、cyclin G1蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 如表3結(jié)果所示，宮頸癌組的cyclin G1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、腫瘤大小、間質(zhì)浸潤(rùn)深度和有無(wú)脈管或?qū)m旁浸潤(rùn)等臨床病理因素均無(wú)明顯關(guān)系(P＞0．05)，但cyclin G1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P ＜0．05)。

3 討論

Cyclin G是一類發(fā)現(xiàn)較晚的細(xì)胞周期蛋白，目前認(rèn)為它的家族可能包括cyclin G1、cyclin G2、cyclin I三個(gè)亞型［2］。雖然cyclin G1和G2在序列上屬同系物，但它們可能各自有獨(dú)特的生理學(xué)作用［3］。cyclin G1 是 1993 年 Tamura 等［4］在鼠成纖維細(xì)胞中意外發(fā)現(xiàn)的，其確切功能至今還不明確。Skotzko等［5］發(fā)現(xiàn)在成骨肉瘤細(xì)胞中有cyclin G1的超表達(dá)和P53、RB抑癌基因的低表達(dá)，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將cyclin G1反義核酸導(dǎo)入成骨肉瘤中，可誘導(dǎo)瘤細(xì)胞的凋亡，這說(shuō)明cyclin G1可能對(duì)成骨肉瘤的發(fā)生有促進(jìn)作用。據(jù)現(xiàn)有資料顯示，cyclin G1的高表達(dá)還與多種消化道腫瘤、白血病等的發(fā)生有關(guān)［6，7］，但cyclin G1表達(dá)與宮頸癌關(guān)系的研究卻鮮有報(bào)道。梁靜等［8］用免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，cyclin G1在正常宮頸組幾乎沒(méi)有表達(dá)，而在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌各組的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，并且在各級(jí)病變宮頸組織中的陽(yáng)性著色區(qū)域和病變區(qū)域基本相符，并因此認(rèn)為cyclin G1的過(guò)度表達(dá)提示宮頸細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)，并與宮頸病變的發(fā)展呈正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)用免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，CIN組與宮頸癌組的cyclin G1 mRNA和cyclin G1蛋白都有高表達(dá)，而且陽(yáng)性表達(dá)部位與宮頸病變部位基本相符;CIN組與宮頸癌組的cyclin G1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0．05)，尤其是cyclin G1蛋白在正常對(duì)照組、CIN組和宮頸癌組的陽(yáng)性表達(dá)率呈逐漸增高趨勢(shì)(P＜0．05)。在正常對(duì)照組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組和宮頸癌組中，cyclin G1 mRNA和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與宮頸病變級(jí)別均呈正相關(guān)(r分別為0．378和0．487)。這提示cyclin G1在宮頸癌的癌前病變中就已顯著升高，可能與宮頸病變的發(fā)展和宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。這與本課題前期研究結(jié)果cyclin G1蛋白在正常對(duì)照組、CIN組和宮頸癌組的陽(yáng)性表達(dá)率呈逐漸增高趨勢(shì)高度一致［1］，也與梁靜［8］的報(bào)道基本相符。

Shimizu 等［9］研究結(jié)果顯示，用 cyclin G1 mRNA反義互補(bǔ)的寡核苷酸可抑制cyclin G1蛋白的表達(dá)，并表明cyclin Gl可能與G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)控有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，cyclin G1蛋白與cyclin G1 mRNA的表達(dá)具有顯著正相關(guān)(r=0．530，P=0．000)，這說(shuō)明cyclin G1蛋白的高表達(dá)可能是其mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高所致，這種高表達(dá)可能會(huì)使宮頸癌細(xì)胞跨越G2/M期調(diào)控點(diǎn)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)宮頸惡性細(xì)胞克隆的無(wú)限增殖。但本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，有16例 cyclin G1蛋白陽(yáng)性表達(dá)而cyclin G1 mRNA卻呈陰性表達(dá)，這可能是所采用的石蠟包埋標(biāo)本會(huì)降解部分mRNA以及會(huì)影響核酸探針的穿透從而降低雜交信號(hào)，使cyclin G1 mRNA出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而cyclin G1蛋白卻相對(duì)穩(wěn)定不容易降解。這也提示進(jìn)一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)最好采用新鮮標(biāo)本冰凍切片。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，cyclin G1 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、腫瘤大小、間質(zhì)浸潤(rùn)深度、有無(wú)脈管或?qū)m旁浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素均無(wú)明顯關(guān)系(P＞0．05)，但cyclin G1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0．05)。這說(shuō)明cyclin G1對(duì)宮頸癌的作用機(jī)制復(fù)雜，可能涉及到更為復(fù)雜的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，但也在一定程度上提示它與宮頸癌惡性侵襲有關(guān)，宮頸癌cyclin G1蛋白的高表達(dá)可能預(yù)示患者預(yù)后不良。

綜上所述，cyclin G1 mRNA和蛋白在宮頸癌中均有高表達(dá)，可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān);cyclin G1蛋白的高表達(dá)可能是其mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高所致，并可能與宮頸癌惡性侵襲有關(guān)。但宮頸癌的發(fā)病原因復(fù)雜，僅僅cyclin G1的過(guò)表達(dá)可能不足以引起多數(shù)宮頸細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，需要多種癌基因和抑癌基因間的相互調(diào)節(jié)，協(xié)同作用。因此，cyclin G1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中更多的作用機(jī)制及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)還有待于進(jìn)一步研究。

1 翁玉英，孫蓬明，林東紅et al．宮頸癌cyclin G1表達(dá)與HPV分子亞型感染的研究［J］．中國(guó)婦幼保健，2010;25(15):2118-2121．

2 Kimura SH，Nojima H．Cyclin G1 associates with MDM2 and regulates accumulation and degradation of p53 protein［J］．Genes Cells，2002;7(8):869-880．

3 Horne M C，Goolsby G L，Donaldson K L et al．Cyclin G1 and cyclin G2 comprise a new family of cyclins with contrasting tissue-specific and cell cycle-regulated expression［J］．J Biol Chem，1996;271(11):6050-6061．

4 Tamura K，Kanaoka Y，Jinno S et al．Cyclin G:a new mammalian cyclin with homology to fission yeast cigl［J］．Oncogene，1993;8(8):2113-2118．

5 Skotzko M，Wu L，Anderson W F etal．Retroviral vectormediated gene transfer of antisense Cyclin Gl(CYC Gl)inhibits proliferation of human osteogenic sarcoma cells［J］．Cancer Res，1995;55(23):5493-5498．

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