曹慧霞，牛福坤，尤冠巧，閻 磊，朱 清，邵鳳民

河南省人民醫(yī)院腎病風濕免疫科鄭州450003

腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進展為終末期腎功能衰竭的共同途徑，而腎小管上皮細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)則是纖維化發(fā)生與進展的重要機制之一。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)是公認的EMT 調(diào)節(jié)因子［1］，參與啟動和完成體內(nèi)整個EMT過程，同時它也能夠誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化。硫化氫(H2S)是近年繼CO、NO之后發(fā)現(xiàn)的第三種內(nèi)源性氣體分子，具有較強的抗炎癥、抗氧化應激和抗細胞凋亡等生理功能［2］。已有研究［3］發(fā)現(xiàn)，血清 H2S可能在慢性腎臟病進程中發(fā)揮重要作用。H2S可以抑制TGF-β1誘導的人肺泡上皮細胞EMT進程，也可以抑制胰腺星狀細胞的EMT［4-5］。而有關(guān)H2S是否可以抑制腎小管上皮細胞EMT進程還不清楚。該研究旨在探討H2S對 TGF-β1誘導腎小管上皮細胞HK-2轉(zhuǎn)分化的影響，并探討其可能機制，為臨床針對腎臟纖維化的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞系(ATCC公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，TGF-β1(Peprotech 公司)，2.5 g/L 胰蛋白酶(Genview公司)，谷氨酰胺和DMSO(Amresco公司)，青霉素及鏈霉素(華北制藥廠)，小鼠抗人E-cadherin及小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體、NaHS(Sigma公司)，兔抗人磷酸化Smad 2/3(p-Smad2/3)多克隆抗體、小鼠抗人Smad2單克隆抗體(Santa Cruz公司)，HRP標記大鼠抗小鼠標記IgG、HRP標記羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) HK-2細胞復蘇后，用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，當傳代細胞長至70% ～80%融合，用無血清培養(yǎng)液靜止24 h進行同步化處理后，用于實驗。

1.3 實驗分組 實驗分4組。正常對照組:常規(guī)培養(yǎng);NaHS組:選用NaHS作為H2S供體，根據(jù)預實驗結(jié)果選用 100 μmol/L NaHS 干預;TGF-β1 組:用 10 μg/L TGF-β1 干預;NaHS+TGF-β1 組:用 TGF-β1(10 μg/L)與 NaHS(100 μmol/L)共同干預。分別于培養(yǎng) 0、15、30和60 min后，收集各組細胞，進行p-Smad2/3和Smad2蛋白檢測;培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞，進行細胞形態(tài)觀察和α-SMA及E-cadherin蛋白檢測。

1.4 目標蛋白的Western blot檢測 在相應時間點棄培養(yǎng)基，PBS清洗細胞2次，加入細胞裂解液裂解細胞，4℃ 1 000 g離心20 min，留取上清。Bradford法測定蛋白濃度。待測樣品按80 μg/孔上樣，行100 g/L SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。50 g/L脫脂奶粉于37℃封閉1 h，加小鼠抗人α-SMA、E-cadherin單克隆抗體(按200倍稀釋)或兔抗人p-Smad2/3多克隆抗體、小鼠抗人Smad2單克隆抗體(按1 000倍稀釋)4℃孵育過夜，加HRP標記的大鼠抗小鼠IgG(按5 000倍稀釋)37℃孵育1 h，ECL顯影成像。以GAPDH為內(nèi)參，應用Quantity One系統(tǒng)對特異性條帶進行吸光度測定，以目標蛋白與GAPDH條帶吸光度的比值表示目標蛋白的相對表達量。以(p-Smad2/3)/Smad2相對表達量的比值表示Smad2/3磷酸化水平。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 15.0進行數(shù)據(jù)分析。4組細胞α-SMA和E-cadherin蛋白相對表達量以及同一時間點(p-Smad2/3)/Smad2的比較采用2×2析因設計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細胞的形態(tài)表現(xiàn) 4組細胞孵育48 h后的形態(tài)見圖1。正常對照組細胞多呈圓形或卵圓形，偶有細胞呈輕度多角形變;NaHS組細胞形態(tài)與正常對照組相似;TGF-β1組細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，大多數(shù)細胞呈長梭形，細胞間隙明顯增寬，類似肌成纖維細胞;NaHS+TGF-β1組細胞發(fā)生梭形變的程度較TGF-β1組明顯減輕。

2.2 4組細胞α-SMA和E-cadherin蛋白的表達結(jié)果見圖2、表1和2。

2.34 組細胞不同時間點(p-Smad2/3)/Smad2的比較 結(jié)果見圖3、表3。

圖1 4組細胞的形態(tài)(倒置顯微鏡，×200)

圖2 4組細胞E-cadherin和α-SMA蛋白的表達

表1 4組細胞E-cadherin蛋白表達的比較(n=3)

表2 4組細胞α-SMA蛋白表達的比較(n=3)

圖3 4組細胞p-Smad2/3和Smad2蛋白的表達

表3 4組細胞(p-Smad2/3)/Smad2比值的比較(n=3)

3 討論

腎小管EMT作為腎小管間質(zhì)纖維化的重要機制之一，近年來一直備受關(guān)注。2002年，Iwano等［6］的研究顯示，在腎間質(zhì)纖維化進程中約36%腎間質(zhì)成纖維細胞來源于EMT，而這些轉(zhuǎn)分化來源的成纖維細胞具有更強的分泌細胞外基質(zhì)的能力。Liu等［7］將EMT的主要過程歸結(jié)為4步:①失去上皮細胞特征，失去上皮間緊密連接，如E-cadherin的表達受抑。②表達間充質(zhì)細胞特征分子，肌動蛋白重排。③腎小管基底膜破壞。④細胞移動性和侵襲性增強。而TGF-β1則被認為是惟一的必須參與啟動和完成整個EMT過程的細胞因子［8］。該研究結(jié)果顯示，應用 10 μg/L TGF-β1 刺激 HK-2 細胞48 h，HK-2細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化，而轉(zhuǎn)分化后的細胞E-cadherin蛋白表達下降，α-SMA蛋白表達升高，證實TGF-β1在腎小管上皮細胞EMT中發(fā)揮了重要作用。

H2S之前一直作為有毒氣體被大家所認識，近些年人們才發(fā)現(xiàn)H2S還是一種具有生理/病理生理功能的內(nèi)源性氣體信號分子。已有的研究顯示，H2S在體內(nèi)心血管、神經(jīng)、消化、呼吸等多個系統(tǒng)均發(fā)揮著重要的生物學效應，其在腎臟中的作用也正受到越來越多的重視。Xia等［9］的研究結(jié)果顯示，腎組織自身可表達胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚合成酶(CBS)等主要的H2S合成酶，用以獨立合成內(nèi)源性H2S;而內(nèi)源性H2S不僅可以通過調(diào)節(jié)腎血管和腎小管活性來參與腎功能的調(diào)控，也可通過維持腎小球結(jié)構(gòu)完整性、感受腎實質(zhì)氧分壓的變化等途徑調(diào)控腎功能。Perna等［10］發(fā)現(xiàn)，血液透析患者血漿H2S濃度顯著降低，體內(nèi)CBS等表達減少，而血中H2S濃度的減少可能是血液透析患者心血管并發(fā)癥形成的重要原因之一。Aminzadeh等［11］在大鼠5/6腎切除模型中同樣發(fā)現(xiàn)H2S濃度和H2S合成酶表達的下降，而體內(nèi)相關(guān)氧化應激產(chǎn)物則顯著增加，推測H2S對慢性腎臟病的影響與其抗氧化應激的作用有關(guān)。陳燊等的系列研究［12-13］結(jié)果顯示，補充外源性H2S有可能通過抑制糖尿病腎病模型大鼠腎臟中成肌纖維細胞的生成，減輕細胞外基質(zhì)的過度積聚，從而有效地抑制糖尿病腎病的病理改變。

雖然到目前為止有關(guān)H2S與EMT或臟器纖維化的關(guān)系研究相對較少，但已有的報道［4-5］結(jié)果均提示H2S可延緩EMT或臟器纖維化進程。該研究以體外培養(yǎng)的HK-2細胞為研究對象，以NaHS作為H2S供體，觀察 H2S對 TGF-β1誘導的 HK-2細胞EMT的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) NaHS+TGF-β1組細胞較TGF-β1組細胞 E-cadherin蛋白表達顯著升高，α-SMA蛋白表達則明顯下降，同時也部分保留了上皮細胞的形態(tài)特征，表明H2S對TGF-β1誘導的人腎小管EMT有抑制作用。

TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路目前被認為是惟一介導TGF-β1胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的通路，而p-Smad2/3是TGF-β1/Smad信號通路中的重要信號轉(zhuǎn)導分子，其蛋白表達量則是TGF-β1/Smad信號通路激活程度的標志。作者分別觀察了TGF-β1組和NaHS組HK-2細胞中p-Smad2/3表達的變化，發(fā)現(xiàn)TGF-β1組p-Smad2/3水平較正常對照顯著增高，NaHS+TGF-β1組卻較 TGF-β1組顯著下降，這與 Fang等［4］在肺泡上皮細胞中的研究結(jié)果一致。提示H2S可能通過抑制Smad2/3磷酸化來干擾TGF-β1誘導的EMT的進程，但其具體的作用機制尚有待進一步研究。

綜上所述，該研究證實H2S可抑制TGF-β1誘導的HK-2轉(zhuǎn)分化進程，而該作用可能在一定程度上通過影響Smad2/3磷酸化水平來完成。

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