趙永福，楊紅星，唐 哲，盧賓賓

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科鄭州450052

X染色體連鎖凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)相關(guān)因子1(XIAP-associated factor-1，XAF1)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，其在所有胚胎組織及成人正常組織中廣泛表達(dá)，但在許多腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株中低表達(dá)甚至不表達(dá)，是一種潛在的腫瘤抑制因子［1-2］。XAF1位點(diǎn)的雜合性缺失及XAF1啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化可能是其表達(dá)被抑制的機(jī)制［3-4］。作者采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylationspecific PCR，MSP)及免疫組化SP法觀察胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及XAF1蛋白的表達(dá)，探討XAF1在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年1月至2011年1月手術(shù)切除的胰腺癌、胰腺良性疾病和正常胰腺標(biāo)本，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。胰腺癌組48例，患者中男36例，女12例，年齡37～75歲，≤55歲13例，＞55歲35例;腫瘤位于胰頭35例，位于胰腺體尾部13例;腫瘤直徑＜3 cm 33例，≥3 cm 15例;組織學(xué)類型為高分化13例，中分化27例，低分化8例;按照2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期6例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例，Ⅳ期7例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。胰腺良性疾病組26例，患者中男9例，女17例;胰島素瘤20例，慢性胰腺炎6例。正常胰腺組15例，患者中男9例，女6例，其中外傷切除胰腺6例，十二指腸腫物切除獲得的正常胰腺9例。所有患者術(shù)前均未給予放化療。

1.2 胰腺組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)采用上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取組織DNA。采用EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒(ZYMO公司)，按照說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。采用GENMED公司MSP試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物參考文獻(xiàn)［5］，甲 基 化 上 游 引 物 序 列 5’-TTTGTA AGAAACGAAATTTAATCGA-3’，位置 －45～ －21;下游引物序列 5’-CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3’，位置+182～+161;擴(kuò)增產(chǎn)物大小228 bp。未甲基化上游引物序列5’-TTTGTAAGAAATGAAATT TAATTGA-3’，位置 －45～ －21;下游引物序列 5’-CTCCTACCCTTAAAACCCACAAT-3’，位置 +182 ～+161;擴(kuò)增產(chǎn)物大小230 bp。MSP反應(yīng)體系為25 μL。甲基化循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性9 min;95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，35 個(gè)循環(huán);72℃終延伸5 min。未甲基化循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性9 min;94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸5 min。取產(chǎn)物5 μL，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。

1.3 胰腺組織中XAF1蛋白檢測(cè)

1.3.1 主要步驟 標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，按免疫組化SP法進(jìn)行染色。切片脫蠟至水，pH 6.8枸櫞酸鈉緩沖液微波加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS沖洗，加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，非免疫動(dòng)物血清37℃封閉30 min。加一抗4℃孵育過(guò)夜(XAF1一抗按250倍稀釋)。PBS沖洗，加二抗、三抗孵育，PBS洗3次，每次5 min。滴加現(xiàn)配的 DAB顯色5 min，PBS終止，蘇木素復(fù)染30 s，鹽酸乙醇分化10 s，氨水返藍(lán)后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。陽(yáng)性對(duì)照為試劑盒內(nèi)提供的陽(yáng)性玻片，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。兔抗人XAF1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP9001試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 結(jié)果判斷 XAF1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞主要表現(xiàn)為胞核和胞質(zhì)棕黃色顆粒或團(tuán)塊狀著色，亦可表達(dá)于核膜。每例觀察5個(gè)高倍視野，根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色程度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分。按陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞著色為0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜20%為1分，20% ～75%為2分，＞75%為3分;按染色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃或棕褐色為3分。兩項(xiàng)積分的乘積為總分，總分達(dá)0～3分為陰性，4～9分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均利用SPSS 17.0進(jìn)行分析，3組組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率及XAF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用Fisher精確概率法或χ2檢驗(yàn)，不同臨床特征胰腺癌患者2指標(biāo)的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson列聯(lián)系數(shù)分析胰腺癌組織中2指標(biāo)表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組胰腺組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)結(jié)果 分別用甲基化引物和未甲基化引物擴(kuò)增經(jīng)修飾的(甲基化陽(yáng)性對(duì)照)和未修飾(甲基化陰性對(duì)照)的健康人外周血DNA，只有M引物和U引物得到預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，提示實(shí)驗(yàn)技術(shù)、引物正確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、表 1。

圖1 胰腺癌和正常胰腺組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)結(jié)果

2.2 3組胰腺組織中XAF1蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖2和表1。

圖2 胰腺癌(A)、良性疾病(B)和正常(C)組織中XAF1蛋白的表達(dá)(SP，×200)

2.3 胰腺癌組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及其蛋白的表達(dá)與胰腺癌臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置無(wú)關(guān)，見(jiàn)表2。

2.4 胰腺癌組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及蛋白表達(dá)的相關(guān)性 見(jiàn)表3，可以看出，胰腺癌組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與XAF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈負(fù)關(guān)聯(lián)(rP= －0.463，P ＜0.001)。

表1 3組胰腺組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及XAF1蛋白的表達(dá) 例(%)

表2 胰腺癌中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 胰腺癌組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和XAF1蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)上研究最深入的一種機(jī)制，被認(rèn)為是繼突變、等位基因丟失后致抑癌基因失活的第二次打擊［6］。抑癌基因由于5’端啟動(dòng)子區(qū)域CpG島異常高甲基化從而抑制了mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，導(dǎo)致該基因的沉默。抑癌基因的功能失活引發(fā)的下游事件導(dǎo)致了正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化調(diào)控失常，與多種腫瘤的形成密切相關(guān)。

XAF1基因位于人類染色體17p13.2位點(diǎn)，有8個(gè)外顯子，由301個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為33 100，含有7個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。XAF1蛋白定位于胞質(zhì)和胞核內(nèi)，與XIAP相互作用后，從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，成為核內(nèi)包涵體。XAF1蛋白可拮抗XIAP對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白酶(caspase)的抑制作用，通過(guò)調(diào)控G2/M檢查點(diǎn)，使G2/M細(xì)胞周期停滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［4］。XAF1 mRNA已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞株及腫瘤組織中低表達(dá)，如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、腎透明細(xì)胞癌、前列腺癌和小細(xì)胞肺癌等［6-9］。有研究［3，6-9］表明，在腫瘤細(xì)胞和組織中，XAF1 基因存在啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化，甲基化程度與XAF1 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，并且與腫瘤的分期、分級(jí)有關(guān)。

在該研究中作者用MSP法檢測(cè)胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示胰腺癌組織中XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率達(dá)31.3%，明顯高于胰腺良性疾病組織及正常胰腺組織。同時(shí)作者用SP法檢測(cè)XAF1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，胰腺癌組織中XAF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于良性疾病組織和正常胰腺組織。進(jìn)一步的分析結(jié)果顯示，XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及XAF1蛋白的表達(dá)與胰腺癌臨床分期、腫瘤組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示XAF1啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是導(dǎo)致該蛋白不表達(dá)的重要機(jī)制之一，最終參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

因此，聯(lián)合檢測(cè)這兩個(gè)因子可能對(duì)胰腺癌的輔助診斷及惡性程度評(píng)價(jià)有一定意義。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)因子在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制方面的進(jìn)一步研究，有望尋找到一個(gè)有助于胰腺癌的早期診斷、惡性程度和預(yù)后判斷的新指標(biāo)。由于XAF1具有拮抗XIAP凋亡抑制作用和控制腫瘤生長(zhǎng)的特性，恢復(fù)XAF1的表達(dá)和功能，以降低XIAP的表達(dá)，有可能成為胰腺癌藥物治療的一個(gè)新思路。

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